白細(xì)胞介素-8對(duì)缺血心肌血管新生的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一章白細(xì)胞介素-8(IL-8)基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建
　　目的:冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê?jiǎn)稱(chēng)冠心病）是威脅中國(guó)公眾健康的重要疾病。研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者產(chǎn)生的冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)(CCC)，有利于維持心肌活力，保護(hù)心功能。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了VEGF、bFGF等促血管生長(zhǎng)因子蛋白和基因（質(zhì)粒、腺病毒）應(yīng)用于缺血心肌可促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)支血管生長(zhǎng)，代償性替補(bǔ)供血血管，增加缺血心肌灌注，減小梗死面積，改善心功能。早期研究發(fā)現(xiàn)IL-8在炎癥中

2、起重要作用，隨著對(duì)IL-8及其受體生物學(xué)活性和作用機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)它還具有促有絲分裂與血管生成的作用，但I(xiàn)L-8是否具有促進(jìn)心肌缺血區(qū)側(cè)支血管生長(zhǎng)，增加缺血心肌灌注未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建IL-8基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體，為研究IL-8在缺血心肌血管新生中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:從購(gòu)買(mǎi)的cDNA文庫(kù)中，利用PCR方法釣取IL-8目的基因。將IL-8目的基因與酶切線(xiàn)性化的慢病毒載體進(jìn)行定向交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)長(zhǎng)

3、出的克隆先進(jìn)行菌落PCR鑒定，再對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。然后將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提，抽提后與兩種輔助包裝原件載體，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度。
　　結(jié)果:1.通過(guò)PCR擴(kuò)增人IL-8基因完整的DNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到343bp的擴(kuò)增產(chǎn)物為

4、IL-8基因。
　　2.IL-8目的基因與酶切線(xiàn)性化的慢病毒載體進(jìn)行定向交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子得到507bp的條帶，陰性轉(zhuǎn)化子得到198bp的條帶，目的基因大小為507bp-198bp=309bp。將陽(yáng)性克隆送Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示:Identities=298/298(100％)，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列(IL-8)完全一致。
　　3.將所制備的各DN

5、A溶液(pGC-FU-IL8-EGFP載體20μg，pHelper1.0載體15μg，pHelper2.0載體10μg)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24-48 h后在熒光顯微鏡下觀察可觀察到綠色熒光。并進(jìn)行Western blot(WB)檢測(cè)，得到約39KD的條帶，為IL-8與GFP融合表達(dá)的條帶。
　　4.病毒收獲及濃縮后，Real time定量PCR法測(cè)定滴度，病毒滴度為2.00E+8 TU/ml。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建IL

6、-8基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體，并在293T細(xì)胞中成功包裝，包裝后檢測(cè)病毒滴度為2.00E+8 TU/ml，為進(jìn)一步研究IL-8在家兔缺血心肌血管新生中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第二章慢病毒介導(dǎo)的IL-8表達(dá)對(duì)兔缺血心肌血管新生的影響及機(jī)制研究
　　目的:IL-8是一種多源的細(xì)胞因子，多種細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人類(lèi)多種腫瘤細(xì)胞等均可合成和分泌IL-8。研究發(fā)現(xiàn)IL-8不僅在炎癥中起重要作用，還發(fā)現(xiàn)它具有促有絲分裂與血

7、管生成的作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者血液中IL-8濃度明顯高于正常人，IL-8參與冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而且有研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的心臟病病人，隨著冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)(CCC)分級(jí)與評(píng)分的升高，病人血清IL-8及MMP-9濃度也相應(yīng)地升高。但I(xiàn)L-8是否可促進(jìn)心肌缺血區(qū)側(cè)支血管生成及可能機(jī)制，均有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬在構(gòu)建IL-8基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體基礎(chǔ)上，以兔心肌梗死為模型，將IL-8基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體局部注射于梗死邊緣區(qū)

8、，分析IL-8能否促進(jìn)冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的建立及其可能機(jī)制。
　　方法:選用健康清潔級(jí)中國(guó)家兔40只，隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組、心肌梗死模型組、心肌梗死+空質(zhì)粒組、心肌梗死+IL-8質(zhì)粒組。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近段制作家兔心肌梗死模型。分別于術(shù)前、造模時(shí)、造模后30分鐘進(jìn)行心電圖檢測(cè)，動(dòng)態(tài)觀察心電圖變化。模型建立后1周、6周行超聲心動(dòng)圖檢查，了解心功能變化。采用H.E染色，觀測(cè)心肌組織不同區(qū)域的組織形態(tài)學(xué)變化;GFP熒光照相檢測(cè)轉(zhuǎn)染情

9、況;采用免疫組化染色，檢測(cè)心肌梗死邊緣區(qū)新生血管的密度。采用Westernblot法檢測(cè)缺血心肌局部IL-8、磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1.造模動(dòng)物40只，造模成功并存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（造模術(shù)后6周）32只，每組各存活8只。
　　2.造模術(shù)中所見(jiàn)、心電圖變化、心臟大體觀測(cè)及病理染色證實(shí)兔心肌梗死模型造模成功。熒光顯微鏡下觀察缺血心肌局部可見(jiàn)綠色熒光，表明GFP標(biāo)記的IL-8慢病毒質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒

10、轉(zhuǎn)染至缺血心肌局部，假手術(shù)組和心梗對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光。
　　3.與假手術(shù)組比較，心梗模型組IL-8的表達(dá)明顯增加(P＜0.01);與心梗模型組比較，IL-8慢病毒質(zhì)粒組IL-8的表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，表明IL-8慢病毒質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至局部缺血心肌?？召|(zhì)粒組與心梗模型組比較IL-8的表達(dá)無(wú)明顯差別（P＞0.05）。
　　4.與假手術(shù)組比較，心梗模型組術(shù)后1周、6周心功能明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與心梗模型組

11、比較，空質(zhì)粒組術(shù)后1周、6周心功能無(wú)明顯差異(P＞0.05);與心梗模型組比較，術(shù)后1周IL-8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組心功能未見(jiàn)改善，術(shù)后6周IL-8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組LVEDd，LVESd減低，LVFS，LVEF增加，示心功能有所改善，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.與假手術(shù)組比較，心梗模型組心肌梗死邊緣區(qū)新生血管密度明顯增加，有顯著性差異(P＜0.01);與心梗模型組比較，IL-8質(zhì)粒組心肌梗死邊緣區(qū)新生血管密度明顯增加，有顯著性差

12、異(P＜0.01);但空質(zhì)粒組與心梗模型組相比新生血管密度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　6.與假手術(shù)組比較，心梗6周后，心梗模型組梗死邊緣局部心肌磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）;與心梗模型組比較，IL-8質(zhì)粒組缺血局部心肌磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表達(dá)進(jìn)一步增加(P＜0.01);但空質(zhì)粒組與心梗模型組比較，二者的表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:1.成

13、功構(gòu)建急性心肌梗死兔模型，并成功將已制備的IL-8慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至缺血心肌局部。
　　2.IL-8可促進(jìn)心肌缺血區(qū)新血管生成，即促進(jìn)側(cè)支血管形成，機(jī)制可能與其Akt的磷酸化、GSK-3βser9的磷酸化有關(guān)。
　　第三章 IL-8對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制研究
　　目的:內(nèi)皮細(xì)胞是覆襯于全身血管和淋巴管內(nèi)面的單層扁平細(xì)胞，具有多種生理功能。它作為組織與血液間的第一道屏障，是最先感受缺氧的細(xì)胞之一。內(nèi)皮細(xì)

14、胞在血管新生中扮演主要的角色，在條件和環(huán)境變化時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞由靜止期轉(zhuǎn)化為分裂期，使其分裂增殖導(dǎo)致血管新生。研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡會(huì)抵消其增殖，從而抑制了血管新生并導(dǎo)致血管的衰退，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可以促進(jìn)血管新生。本部分制備缺氧的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分析IL-8對(duì)缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能機(jī)制。
　　方法:用不同濃度的CoCl2（50、100、200、400μmol/L）培養(yǎng)HUVECs12、24、48h，MTT比色法分

15、析細(xì)胞存活率，選擇合適濃度CoCl2制備缺氧HUVECs;用不同濃度的Recombinant Human IL-8(1、10、50、100 ng/ml)培養(yǎng)缺氧HUVECs，MTT比色法分析細(xì)胞存活率，選擇合適濃度及時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行下一步的機(jī)制研究。取正常HUVECs及缺氧HUVECs，分別加入Recombinant Human IL-8(10ng/ml)、Anti-IL-8（10μg/ml）、LY294002(20μmol/L)處理細(xì)胞48

16、h后，MTT比色法分析細(xì)胞存活率，AnnexinⅤ/PI法檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，采用Western blot法檢測(cè)磷酸化AKT、磷酸化GSK-3βser9、Caspase3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.不同濃度CoCl2處理HUVECs12h，低濃度CoGl2(50，100μmol/L)有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用（P＜0.01），高濃度CoCl2(200，400μmol/L)無(wú)明顯作用;處理24h，低濃度CoCl2(50μmol/L)

17、有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用(P＜0.01)，高濃度CoCl2(200，400μmol/L)抑制細(xì)胞增殖(P＜0.01);處理48h，低濃度CoCl2(50，100μmol/L)無(wú)明顯作用，高濃度CoCl2(200，400μmol/L)明顯抑制細(xì)胞增殖(P＜0.01)。
　　2.IL-8(1，10，50，100ng/ml)處理缺氧HUVECs孵育24h，可改善缺氧所致的HUVECs增殖的抑制作用，但沒(méi)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。處理48h、72h后，

18、1ng/ml IL-8可改善缺氧所致的HUVECs增殖的抑制作用，但沒(méi)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;10，50，100ng/ml可明顯改善缺氧所致的HUVECs增殖的抑制作用，表現(xiàn)出促細(xì)胞增殖能力（P＜0.01）。
　　3.在正常HUVECs組中，與對(duì)照組比較，IL-8(10ng/ml)可明顯促進(jìn)HUVECs增殖，抑制HUVECs凋亡，LY294002(20μM)或IL-8抗體(10μg/ml)明顯抑制IL-8的促細(xì)胞增殖作用，拮抗IL-8的抑

19、制細(xì)胞凋亡作用（P＜0.01）。在缺氧HUVECs組中，與正常對(duì)照組比較，缺氧組細(xì)胞存活率明顯下降，凋亡明顯增加(P＜0.01);與缺氧組相比，IL-8(10ng/ml)可明顯促進(jìn)缺氧HUVECs增殖，抑制缺氧HUVECs凋亡，LY294002(20μM)或IL-8抗體(10μg/ml)明顯抑制IL-8的促細(xì)胞增殖作用，拮抗IL-8的抑制細(xì)胞凋亡作用(P＜0.01)。
　　4.與正常對(duì)照組比較，缺氧組磷酸化Akt、磷酸化GSK-3

20、βser9的表達(dá)明顯下降，Caspase3的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。在正常HUVECs組中，與正常對(duì)照組比較，IL-8(10ng/ml)可明顯上調(diào)磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表達(dá)，下調(diào)Caspase3的表達(dá)，LY294002(20μM)或IL-8抗體(10μg/ml)明顯抑制IL-8對(duì)正常HUVECs磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9表達(dá)上調(diào)作用，拮抗IL-8對(duì)正常HUVECs Caspase3表達(dá)的下調(diào)作用(

21、P＜0.01)。在缺氧HUVECs組中，與缺氧組比較，IL-8(10ng/ml)可明顯上調(diào)磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表達(dá)，下調(diào)Caspase3的表達(dá)，LY294002(20μM)或IL-8抗體(10μml)明顯抑制IL-8對(duì)缺氧HUVECs磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9表達(dá)上調(diào)作用(P＜0.01)，拮抗IL-8對(duì)缺氧HUVECs Caspase3表達(dá)的下調(diào)作用（P＜0.01）。
　　結(jié)論:CoCl2誘導(dǎo)的