DNA雙鏈斷裂損傷及同源重組修復(fù)參與人絨癌細(xì)胞化療高敏的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.驗(yàn)證甲氨蝶呤（MTX）及順鉑是否能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂損傷。
　　2.研究 DNA雙鏈斷裂損傷及同源重組修復(fù)通路是否參與介導(dǎo)人絨毛膜癌細(xì)胞的化療高敏性。
　　材料和方法:
　　1．細(xì)胞系：（1）甲氨蝶呤高敏組：人絨毛膜癌細(xì)胞株 JAR，JEG-3；（2）甲氨蝶呤敏感組：骨肉瘤細(xì)胞株 MG63；（3）甲氨蝶呤不敏感組：上皮性卵巢癌細(xì)胞株A2780以及宮頸腺癌細(xì)胞株Hela；
　　2．M

2、TT法檢測上述五株腫瘤細(xì)胞對甲氨蝶呤的敏感性，并根據(jù)半數(shù)抑制濃度（IC50）選擇合適的藥物處理濃度及濃度梯度。
　　3．中性彗星實(shí)驗(yàn)檢測甲氨蝶呤是否能誘導(dǎo)上述五株腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂損傷；
　　4．Western Blot檢測甲氨蝶呤敏感細(xì)胞株中藥物處理后DNA雙鏈斷裂損傷標(biāo)志物γH2AX蛋白的表達(dá)水平；
　　5．RT-PCR檢測濃度梯度藥物處理后上述五株細(xì)胞同源重組修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)水平的差異；
　　6．W

3、estern Blot驗(yàn)證同源重組修復(fù)差異蛋白的表達(dá)水平以及凋亡蛋白p53的表達(dá)變化。
　　7．將甲氨蝶呤替換為順鉑，在兩株人絨毛膜癌細(xì)胞株 JAR及 JEG-3中，重復(fù)MTT，中性彗星實(shí)驗(yàn)，RT-PCR和Western Blot試驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1. MTT檢測不同濃度的甲氨蝶呤處理人絨毛膜癌細(xì)胞 JAR、JEG-3、骨肉瘤細(xì)胞 MG63、上皮性卵巢癌細(xì)胞 A2780及宮頸腺癌細(xì)胞 Hela的藥物敏感性。結(jié)果：

4、 JAR、JEG-3、MG63對甲氨蝶呤敏感，IC50分別是：28.39±3.02μM，23.70±2.58μM，30.92±3.51μM； A2780及Hela對甲氨蝶呤的IC50>400μM。
　　2.用五株細(xì)胞對應(yīng)的甲氨蝶呤IC50分別處理細(xì)胞24h和48h以后，通過中性彗星實(shí)驗(yàn)檢測到 JAR、JEG-3細(xì)胞有明顯拖尾現(xiàn)象，平均尾長分別為88.50±2.31μm、121.71±5.21μm；平均尾相分別為30.97±2.86

5、、41.85±5.59。MG63細(xì)胞只有輕微的拖尾現(xiàn)象：平均尾長為47.54±2.52μm，平均尾相為14.65±3.29；各組細(xì)胞的平均尾長和平均尾相與對照組相比，P<0.05，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而A2780和Hela細(xì)胞則未觀察到細(xì)胞拖尾現(xiàn)象。
　　3.Western Blot檢測甲氨蝶呤以不同濃度及不同時間處理的JAR、JEG-3、MG63細(xì)胞中γH2AX蛋白的表達(dá)。結(jié)果：隨著甲氨蝶呤作用濃度升高及作用時間的延長，絨癌

6、細(xì)胞 JAR、JEG-3中γH2AX蛋白表達(dá)水平明顯升高；在MG63細(xì)胞中γH2AX蛋白表達(dá)水平開始有略微升高，但隨著藥物作用濃度的增加和作用時間的延長，γH2AX蛋白表達(dá)水平降低或不表達(dá)。
　　4. PCR檢測甲氨蝶呤以不同濃度處理的JAR、JEG-3、MG63、A2780、Hela細(xì)胞中同源重組修復(fù)相關(guān)基因 RAD51、RAD52、BRCA1、BRCA2的表達(dá)。結(jié)果：甲氨蝶呤處理的JAR、JEG-3細(xì)胞中 RAD51的表達(dá)顯著

7、抑制，P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而 RAD52、BRCA1、BRCA2的表達(dá)未見顯著差異；MG63細(xì)胞中 RAD51的表達(dá)有輕微抑制，余基因未見明顯改變；A2780、Hela細(xì)胞中四種關(guān)鍵的同源重組修復(fù)基因的表達(dá)水平均無差異。
　　5.Western Blot檢測甲氨蝶呤以不同濃度及不同時間處理的JAR、JEG-3、MG63細(xì)胞中 RAD51蛋白、p53的表達(dá)。結(jié)果：JAR、JEG-3細(xì)胞中RAD51的表達(dá)被抑制，p53表達(dá)

8、升高，呈顯著的濃度和時間依賴效應(yīng)，而MG63中 RAD51蛋白的表達(dá)僅有輕微降低，p53表達(dá)量短暫升高，并隨著刺激時間的推移，抑制效應(yīng)解除，p53表達(dá)降低。
　　6.順鉑以不同濃度和時間處理JAR、JEG-3細(xì)胞，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟。結(jié)果：兩株絨癌細(xì)胞JAR、JEG-3對順鉑都是極其敏感的，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為1.72±0.56μM，1.53±0.22μM。中性彗星實(shí)驗(yàn)檢測順鉑以相應(yīng)的IC50濃度分別處理兩株絨癌細(xì)胞24h

9、和48h后，未觀察到明顯的細(xì)胞拖尾現(xiàn)象。順鉑濃度梯度及時間梯度刺激后，細(xì)胞內(nèi)γH2AX在高濃度及長時間作用下表達(dá)升高，相應(yīng)的RAD51蛋白的表達(dá)水平也同步升高，而凋亡蛋白p53及Caspase3表達(dá)水平也隨著順鉑處理濃度及時間的增加而升高。
　　結(jié)論:
　　1． MTX誘導(dǎo)人絨癌細(xì)胞持續(xù)性 DNA雙鏈斷裂損傷，同時其同源重組修復(fù)蛋白 RAD51的表達(dá)易被抑制，這種易損傷及低修復(fù)的特性可能介導(dǎo)其化療高敏性；
　　2．順鉑