DNA雙鏈斷裂末端的Ku70-80結(jié)合對(duì)同源重組修復(fù)通路的影響.pdf

1、我們的遺傳物質(zhì)DNA不斷受到諸如化學(xué)物質(zhì)、電離輻射和紫外光等外源因素和代謝產(chǎn)物及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等內(nèi)源性因素的損傷。DNA雙鏈斷裂(DNA double strands break，DSB)是最嚴(yán)重的DNA損傷之一，未修復(fù)或者錯(cuò)誤修復(fù)的DSB會(huì)導(dǎo)致基因組重排、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生和免疫缺陷。真核細(xì)胞依靠DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)網(wǎng)絡(luò)通過(guò)一系列的信號(hào)

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)放大，最終走向DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡或染色體重構(gòu)等結(jié)局來(lái)保護(hù)基因組的完整性。在DSB發(fā)生時(shí)，DDR通過(guò)細(xì)胞周期阻滯和兩種DSB修復(fù)通路：同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)來(lái)進(jìn)行DNA修復(fù)。
　　HR需要同源模板的存在來(lái)進(jìn)行高保真的修復(fù)，而NHEJ則使用各種酶直接連接兩個(gè)斷裂的末端，因此保真度不如HR，但NHEJ可以連接

3、幾乎任何類(lèi)型的DSB末端。不同的細(xì)胞類(lèi)型會(huì)偏重不同的修復(fù)通路，此外，還有兩種因素參與DSB修復(fù)通路選擇的調(diào)節(jié)：細(xì)胞周期的時(shí)期和DNA末端剪切。HR傾向于使用姐妹染色單體作為同源模板，因此被認(rèn)為只在存在姐妹染色單體的S期和G2期活躍；NHEJ不局限于細(xì)胞周期的任何時(shí)期.但通常在GO期和G1期占優(yōu)勢(shì)。HR需要DNA末端剪切產(chǎn)生的3’端單鏈DNA突出來(lái)進(jìn)行鏈侵入和配對(duì)，而NHEJ的發(fā)起因子Ku70/80雖然對(duì)于雙鏈DNA(Double str

4、ands DNA，dsDNA)具有很高的親和性，但對(duì)于單鏈DNA(single strand DNA，ssDNA)的親和性減弱，因此末端剪切會(huì)推動(dòng)DSB修復(fù)向HR方向進(jìn)行。直接競(jìng)爭(zhēng)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，在細(xì)胞周期的S期和G2期，末端剪切發(fā)起因子MRN(X)(Mrell-Rad50-Nbs1/Xrs2)復(fù)合物和Ku70/80直接競(jìng)爭(zhēng)DSB末端，而MRN首先占據(jù)DSB末端并迅速形成ssDNA來(lái)抑制Ku70/80與DSB末端的結(jié)合，從而使HR通路占據(jù)優(yōu)勢(shì)

5、。直接競(jìng)爭(zhēng)學(xué)說(shuō)得到一些證據(jù)支持，但新的數(shù)據(jù)卻發(fā)現(xiàn)Ku70/80對(duì)DNA的親和性高于HR，因而該學(xué)說(shuō)可能存在一定問(wèn)題。因此，我們針對(duì)Ku70/80復(fù)合物與DSB末端結(jié)合是否有周期依賴(lài)性，以及這種結(jié)合對(duì)HR的影響展開(kāi)了研究。
　　我們的實(shí)驗(yàn)中顯示，盡管NHEJ通路主要在G0和G1期占優(yōu)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的S期當(dāng)HR作為主要的修復(fù)方式時(shí)，NHEJ的因子Ku80也可以聚集到DSB位點(diǎn)。并且其初始的聚集和在DSB位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)特征與Ku80在非

6、S期的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中相似。我們發(fā)現(xiàn)來(lái)自結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的Ku的同源物Mt-Ku可以在S期定位到365 nm脈沖氮?dú)饧す庠斐傻腄SB位點(diǎn)，并且可以較長(zhǎng)時(shí)間滯留，因此我們使用其作為工具來(lái)測(cè)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，DSB末端被長(zhǎng)時(shí)間的阻滯是否會(huì)影響DNA末端剪切和HR通路。DNA末端剪切產(chǎn)生的3’突出端會(huì)馬上被RPA包被；而B(niǎo)rdU抗體只能識(shí)別整合在ssDNA中的BrdU，因此RPA和BrdU焦點(diǎn)的形

7、成就分別被作為ssDNA形成的間接和直接的測(cè)量手段。Rad51是介導(dǎo)鏈侵入和配對(duì)的不可或缺的HR因子，因此成為廣泛接受的HR修復(fù)的標(biāo)記物。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，在Ku缺失的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中補(bǔ)充Mt-Ku后，可見(jiàn)電離輻射(ironizing mdiation，IR)損傷后RPA，BrdU和Rad51焦點(diǎn)的形成明顯下降，表明DNA末端剪切和HR介導(dǎo)的DSB修復(fù)的下降。HR實(shí)驗(yàn)中Mt-Ku轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞HR完成百分比的減少也進(jìn)一步證實(shí)了

8、這一結(jié)論。Mt-Ku轉(zhuǎn)染并不能改善Ku80缺失細(xì)胞的IR敏感性，表明Mt-Ku不僅無(wú)法介導(dǎo)NHEJ通路的進(jìn)行，其長(zhǎng)期占據(jù)DSB末端也造成了HR修復(fù)能力的減弱。
　　我們進(jìn)一步探求了介導(dǎo)人類(lèi)Ku70/80從DSB末端解聚的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)室前期的Ku80動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明人類(lèi)細(xì)胞在磷脂酰肌醇3激酶樣蛋白激酶(phosphatidylinositol3-kinase-like protein kinase，PIKKs)家族抑制劑wor

9、tmannin的作用下，激光損傷后120 min Ku80仍可滯留在DSB末端。本研究中的免疫染色實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示wortmannin導(dǎo)致了IR后RPA和Rad51焦點(diǎn)形成的減少，揭示了Ku的磷酸化在其解聚中所扮演的角色。為了尋找介導(dǎo)Ku解聚相關(guān)的磷酸化的特異性激酶，我們?cè)诩す鈸p傷前使用ATM特異性抑制劑KU-55933和DNA-PKcs特異性抑制劑NU-7441進(jìn)行處理。NU-7441成功的造成了Ku80在DSB末端的長(zhǎng)時(shí)間滯留，并且造

10、成了IR后RPA焦點(diǎn)形成的減少。盡管KU-55933單獨(dú)作用并不能對(duì)Ku80的動(dòng)態(tài)學(xué)特征產(chǎn)生影響，但當(dāng)與NU-7441聯(lián)合作用時(shí)，它們?cè)斐闪薎R后RPA焦點(diǎn)的明顯減少，表現(xiàn)出了明顯增強(qiáng)的DSB末端阻滯效果。這些結(jié)果表明Ku從DSB末端的解聚與DNA-PKcs介導(dǎo)的Ku的磷酸化相關(guān)，并且ATM可以增強(qiáng)DNA-PKcs的磷酸化效果?？偠灾?，以上數(shù)據(jù)表明了Ku70/80在細(xì)胞周期的任何時(shí)期都可以與DSB結(jié)合，并在ATM的幫助下經(jīng)由DNA-P