胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的Ku70-80復(fù)合物識(shí)別HBV DNA誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性相關(guān)趨化因子.pdf

1、乙肝病毒(HBV)感染引起的乙型肝炎，是一個(gè)全球性的健康問題，世界各地約有3500萬慢性乙肝病毒感染者，嚴(yán)重地威脅患者生命安全。隨著研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)慢性乙肝患者出現(xiàn)肝炎癥狀時(shí)，表明機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)體內(nèi)所存在的含有HBV快速復(fù)制的肝細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其中HBV特異性CD8+T細(xì)胞作為主要的效應(yīng)細(xì)胞起著關(guān)鍵性的作用，NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞和其他免疫相關(guān)的細(xì)胞也發(fā)揮著一定的作用。然而，這些細(xì)胞是如何招募到發(fā)病部位從而行使功能的機(jī)制仍不

2、清楚，這也是我們關(guān)心的問題，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)以及所獲得的數(shù)據(jù)分析，我們得出以下幾方面結(jié)果:
　　1.通過使用Gene Expression Omnibus(GEO)網(wǎng)站，對(duì)不同的乙型肝炎相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們觀察到在乙肝病毒感染引起炎癥的患者肝組織中，趨化因子的差異程度和表達(dá)上的相對(duì)值和絕對(duì)值，變化都非常的明顯。并且在接受抗病毒治療的乙肝患者血清中，我們也檢測(cè)到隨著患者病情的減輕，病毒滴度的降低，趨化因子CCL5的含量也顯著

3、降低。這一結(jié)果預(yù)示著趨化因子CCL5在乙型肝炎中，可能扮演非常重要的角色。
　　2.利用Ad-HBV感染的小鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)Ad-HBV感染會(huì)導(dǎo)致小鼠肝臟中炎性趨化因子CCL3和CCL5的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨著大量淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)和血清中ALT水平的升高。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道其配體CCR5在乙型肝炎中的重要作用，推測(cè)CCL3和CCL5可能是招募淋巴細(xì)胞到達(dá)肝臟的關(guān)鍵性趨化因子。
　　3.HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝臟來源細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)來源的細(xì)胞

4、系無法產(chǎn)生趨化因子，而肝臟內(nèi)皮來源的細(xì)胞中可以產(chǎn)生大量趨化因子。由于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，乙肝病毒可以復(fù)制，文獻(xiàn)報(bào)道表明乙肝病復(fù)制產(chǎn)物，會(huì)抑制細(xì)胞內(nèi)天然免疫相關(guān)的信號(hào)通路。所以我們推測(cè)肝臟中的趨化因子來源可能不是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，而是內(nèi)皮細(xì)胞。
　　4.我們對(duì)HBV DNA進(jìn)行標(biāo)記后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并拉下DNA結(jié)合蛋白。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示，Ku70/80分子能夠結(jié)合HBV DNA。Ku70/80復(fù)合物是已知的DNA識(shí)別受體，可以識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的多種DNA

5、分子。在HepG2.2.15細(xì)胞中，我們也觀察到Ku70/80分子與HBcAg形成共定位，暗示其可能識(shí)別HBV DNA分子。對(duì)Ku70分子干擾后，細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCL3和CCL5的水平會(huì)大幅降低。
　　5.對(duì)轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行Ku70分子的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PARP1分子可以結(jié)合Ku70/80復(fù)合物。免疫熒光結(jié)果也顯示，PARP1可以與Ku70/80復(fù)合物在胞質(zhì)中形成共定位。干擾PARP1的表達(dá)，同樣抑制趨化因子的上調(diào)。

6、說明PARP1確實(shí)參與Ku70/80識(shí)別HBV DNA，促進(jìn)趨化因子產(chǎn)生的信號(hào)通路。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，這條通路的下游的IRF1分子，在細(xì)胞受到HBV DNA刺激后，IRF1與Ku70/80復(fù)合物在胞質(zhì)中形成共定位，并且出現(xiàn)入核現(xiàn)象。
　　通過以上五方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了一條由Ku70/80識(shí)別HBV DNA介導(dǎo)的，通過PARP1和IRF1誘導(dǎo)炎性趨化因子CCL3，CCL5上調(diào)的信號(hào)通路。基因表達(dá)芯片結(jié)果顯示，產(chǎn)生的趨化因子CCL