DNA損傷修復(fù)復(fù)合物FANCM-MHF和Shu的結(jié)構(gòu)功能研究.pdf

1、遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性是生命活動存在和延續(xù)的基礎(chǔ)。作為遺傳信息的載體，DNA分子在受到外界因素如紫外線、紅外線或者藥物分子等刺激后，會發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化。不僅如此，在正常的細(xì)胞代謝過程中如DNA復(fù)制和重組，DNA也會產(chǎn)生錯誤的中間體。這些DNA分子結(jié)構(gòu)的變化往往導(dǎo)致基因突變，若得不到及時修復(fù)，它們會造成嚴(yán)重的后果一細(xì)胞的死亡和癌變。為了避免這種情況，生物體進(jìn)化出多種來修復(fù)各種各樣DNA損傷的機(jī)制如核苷酸切除修復(fù)，同源重組修復(fù)等。
　　

2、在細(xì)胞分裂期中，DNA鏈間交聯(lián)(Interstrandcrosslinks，ICLs)是一種嚴(yán)重的損傷，它會阻礙復(fù)制叉的前進(jìn)，使DNA復(fù)制受阻，細(xì)胞進(jìn)而也無法完成細(xì)胞周期。人源細(xì)胞中存在一條專門應(yīng)對這類突變的信號通路，被稱為范可尼貧血信號通路(Fanconianemiapathway)。該通路由一系列蛋白介導(dǎo)，這些蛋白的突變會導(dǎo)致范可尼貧血癥(Fanconianemia，F(xiàn)A)的發(fā)生。到目前為止，人們已發(fā)現(xiàn)有15種蛋白(FA蛋白)的突變

3、會產(chǎn)生FA。除了FA蛋白外，還存在多種FA輔助因子，它們對FA通路的激活起關(guān)鍵作用。FANCM是FA核心復(fù)合物的組成元件，它與兩個輔助因子，MHF1和MHF2，相互作用并共同定位到染色體上。
　　 FANCM/MHF1/MHF2復(fù)合物在ICLs識別中起作用，并能招募FA核心復(fù)合物在染色體上的裝配。
　　 本文以FANCM/MHFl/MHF2復(fù)合物為研究對象，解析了MHFl/MHF2以及FANCM661-800/MHFl/

4、MHF2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示MHFl和MHF2都具有典型的組蛋白折疊結(jié)構(gòu)，以頭尾相接的方式形成異二聚體，并進(jìn)一步形成(MHFl-MHF2)2四聚體。相較于組蛋白(H3-H4)2四聚體，(MHFl-MHF2)2四聚體有著更致密的結(jié)構(gòu)，主要由分子內(nèi)疏水作用和特殊的四聚體作用面導(dǎo)致。胞內(nèi)免疫共沉淀和熒光實(shí)驗(yàn)顯示(MHFl-MHF2)2四聚體是其發(fā)揮功能的基本單位，任何結(jié)構(gòu)上的破壞都將導(dǎo)致復(fù)合物組裝的失敗。FANCM通過兩個串聯(lián)的“V”型

5、結(jié)構(gòu)結(jié)合(MHFl-MHF2)2四聚體，并與之形成了巨大的作用界面。結(jié)構(gòu)分析和功能研究結(jié)果表明，F(xiàn)ANCM和MHF有協(xié)同結(jié)合DNA能力，除了(MHFl-MHF2)2四聚體經(jīng)典的LlL2結(jié)合位點(diǎn)外，F(xiàn)ANCM與(MHFl-MHF2)2結(jié)合后形成了一個新的DNA結(jié)合位點(diǎn)。通過結(jié)合DNA，(MHFl-MHF2)2四聚體幫助FANCM在染色體上的定位。而在FA病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的FANCMS724X終止突變，破壞了FANCM的雙“V”結(jié)構(gòu)的形成，使只

6、有N端“V”結(jié)構(gòu)域的FANCM不能有效地結(jié)合MHF，也從而無法完成染色體定位，這可能導(dǎo)致了FA的發(fā)生。
　　 細(xì)胞除了能精確去除突變，它們還可以保留畸變而完成DNA復(fù)制，這被稱為DNA損傷容限(DNAdamagetolerance，DDT)，是一種保守的保護(hù)機(jī)制，普遍存在于原核和真核細(xì)胞中。在釀酒酵母中，DDT存在兩條平行的下游通路:一個是易錯型(TLS)，另一個是無錯型通路(error-freeDDT)。PCNA蛋白的單泛素化

7、修飾激活了前者，其多泛素化修飾激活了無錯型通路。無錯型通路需要同源重組裝置，利用新復(fù)制的姐妹染色單體做模板，實(shí)現(xiàn)DNA的突變跨過性復(fù)制，但是這個通路的具體分子機(jī)制還不清楚。釀酒酵母Shu復(fù)合物被認(rèn)為在無錯型DDT中起作用，它將同源重組和error-freePRR偶聯(lián)起來。Shu復(fù)合物其實(shí)是同源重組拮抗蛋白Srs2的調(diào)節(jié)因子，通過抑制Srs2的活性促進(jìn)了同源重組修復(fù)。Shu復(fù)合物含有四個亞基-Shu1、Shu2、Psy3和Csm2，只有完

8、整的Shu復(fù)合物才能在DNA損傷修復(fù)中起作用。雖然Shu復(fù)合物有著重要的作用，但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還一無所知。
　　 我們解析了Psy3-Csm2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們雖然一級序列同源性很低，但卻擁有類似的三級結(jié)構(gòu)，和Rad51的結(jié)構(gòu)高度相似。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)Psy3通過一個疏水核心同Csm2形成穩(wěn)定的異二聚體。與Rad51一樣，Psy3和Csm2結(jié)構(gòu)中都含有一個富含堿性殘基的L2loop。Psy3和Csm2的L2loop都是