C-型利尿鈉肽對(duì)血管外膜慢性損傷大鼠頸埃及舒縮功能保護(hù)作用機(jī)制及藥物干預(yù)研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是一種多器官受累的常見血管疾病,高血壓、冠心病為其重要并發(fā)癥,成為日益威脅人類生命的主要死亡原因之一,其危害性已舉世公認(rèn)。它是許多心血管疾病的病理基礎(chǔ),主要累及大型及中型肌彈力型動(dòng)脈,以主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈及腦動(dòng)脈為多見,常導(dǎo)致管腔閉塞或管壁破裂出血等嚴(yán)重后果,動(dòng)脈硬化早期受累血管常伴有血管收縮性增強(qiáng),并導(dǎo)致血管痙攣。動(dòng)脈壁具有三層結(jié)構(gòu):內(nèi)膜、中膜、外膜。每一層均具有獨(dú)特的組織學(xué)、生物學(xué)及功能特征,并且每層以獨(dú)特的方式來維持血管

2、穩(wěn)定及調(diào)節(jié)血管對(duì)各種刺激及損傷的反應(yīng)。近二十年來,有關(guān)血管內(nèi)膜對(duì)血管功能的影響進(jìn)行了深入廣泛地研究,血管內(nèi)膜在調(diào)節(jié)血管平滑肌功能中的作用已得到普遍的認(rèn)同。但是,越來越多的證據(jù)顯示外膜調(diào)節(jié)血管功能的作用遠(yuǎn)大于其作為血管壁支撐結(jié)構(gòu)的作用。近年來有關(guān)血管外膜在調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮功能中的作用方面的研究日益受到關(guān)注。1994年,Shimokawa等用IL-1β包裹豬冠狀動(dòng)脈外膜介導(dǎo)冠脈病變的動(dòng)物模型,證明在體情況下,血管外膜慢性炎癥刺激能導(dǎo)致血管

3、收縮反應(yīng)性增高,提示血管外膜能調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮功能,參與血管張力的調(diào)節(jié);用硅膠管包裹兔頸動(dòng)脈的動(dòng)物模型已成為研究動(dòng)脈粥樣硬化的經(jīng)典動(dòng)物模型。此動(dòng)物模型以硅膠管包裹血管導(dǎo)致血管外膜慢性損傷但不直接損傷血管中膜及內(nèi)膜,產(chǎn)生具有人動(dòng)脈粥樣硬化早期特征的新生內(nèi)膜病損;除新生內(nèi)膜形成外,硅膠管包裹還能引起與早期人類動(dòng)脈粥樣硬化病變相似的血管功能的變化:對(duì)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的收縮血管活性高敏感。

4、>　　 C.型利尿利鈉肽(C-type natfiuretic peptide,CNP)作為鈉尿肽家族的新成員,其生理作用十分廣泛,但是目前關(guān)于CNP的臨床研究報(bào)道甚少,由于A-型利尿利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和B-型利尿利鈉肽(brain nalriuretic peptide,BNP)的臨床意義極受重視而且研究廣泛,故近年CNP在疾病中的應(yīng)用研究逐漸增多,尤其發(fā)現(xiàn)CNP與血管損傷性疾病關(guān)

5、系密切。在心血管系統(tǒng)中CNP主要與B型利尿鈉肽受體(NPR-B)結(jié)合,激活顆粒型鳥苷酸環(huán)化酶(particulate guanylylcyclase,pGC)生成環(huán)磷鳥苷酸(Cyclic Guanosine Monophosphate,cGMP),環(huán)磷鳥苷酸依賴的蛋白激酶(cGMP-Dependent Protein Kinase G,PKG)I是cGMP的主要細(xì)胞內(nèi)受體,在cGMP介導(dǎo)的多種生理過程中發(fā)揮著核心作用,如調(diào)節(jié)血管平滑肌的

6、收縮和舒張,抗高血壓,抗心肌肥大,抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗血管損傷/再狹窄等。
　　 既往實(shí)驗(yàn)雖然已經(jīng)證實(shí)硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈導(dǎo)致血管中膜持續(xù)性收縮及對(duì)5-HT收縮血管反應(yīng)敏感性增加,但是機(jī)理不是十分清楚。
　　 目的：
　　 基于以上研究及理論基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了利用硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈制備血管外膜慢性損傷刺激導(dǎo)致血管收縮性增強(qiáng)的動(dòng)物模型,觀察血管外膜慢性損傷對(duì)血管收縮功能的影響以及血清及局部組織中CNP和其下游靶點(diǎn)c

7、GMP、PKG I的表達(dá)和變化;并且應(yīng)用不同劑量的通心絡(luò)和經(jīng)典的調(diào)脂藥物阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù),觀察傳統(tǒng)中醫(yī)絡(luò)病理論指導(dǎo)下研制的復(fù)方制劑通心絡(luò)超微粉劑慢性治療對(duì)該動(dòng)物模型的影響,探討通心絡(luò)和他汀類藥物降低血管收縮反應(yīng)性的機(jī)制:是否與增加了血清和血管組織中的CNP有關(guān)。
　　 方法：
　　 一、動(dòng)物模型部分
　　 用硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈制備血管外膜慢性損傷介導(dǎo)血管收縮性增高的動(dòng)物模型:12周的雄性SD大鼠,體重220-

8、250克。普通大鼠食料喂養(yǎng)1周后分成5組,每組12只,除空白對(duì)照組外,其它組腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛0.3ml/100g麻醉大鼠,用內(nèi)徑1.5mm,長10mm的硅膠管縱向切開后包裹于右側(cè)頸動(dòng)脈外,縫合傷口。實(shí)驗(yàn)共分為5組:①正常組:普通飲食2周。②手術(shù)對(duì)照組(即模型組):普通飲食喂養(yǎng)1周,硅膠管包裹右側(cè)頸動(dòng)脈1周,繼續(xù)普通飲食。③藥物干預(yù)組:本組包括一個(gè)阿托伐他汀組和兩個(gè)通心絡(luò)超微粉組:普通飲食+阿托伐他汀鈣片(5mg/kg/day)喂

9、養(yǎng)1周,硅膠管包裹右側(cè)頸動(dòng)脈1周,繼續(xù)給予普通飲食+阿托伐他汀鈣片(5mg/kg/day)喂養(yǎng);普通飲食+兩個(gè)不同劑量的通心絡(luò)超微粉(300mg/kg/day,600mg/kg/day)喂養(yǎng)1周,硅膠管包裹右側(cè)頸動(dòng)脈1周,繼續(xù)給予普通飲食+不同劑量的通心絡(luò)。于包管術(shù)后1周,用超聲外周血管血流量測定儀測量大鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈血流量,并觀察血管對(duì)局部應(yīng)用5-HT的反應(yīng);并且取雙側(cè)頸動(dòng)脈標(biāo)本,HE染色,光鏡下觀察血管外膜慢性損傷對(duì)血管形態(tài)學(xué)的影響;

10、運(yùn)用elisa的方法測定各組血清中的CNP含量、血管組織中cGMP含量:運(yùn)用蛋白印記的方法測定血管組織中CNP、PKGⅠα、PKGⅠβ的表達(dá)。
　　 二、細(xì)胞培養(yǎng)部分
　　 體外大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的方法測定在不同的濃度(10-5M～10-9M)、在不同時(shí)間點(diǎn)(0,5,10,15,20,30分鐘)下CNP刺激平滑肌細(xì)胞生成的cGMP的含量,選取合適的CNP濃度和時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn);利用

11、Westen-blot的方法測定在不同時(shí)間點(diǎn)(0,5,10,15,20,30分鐘)下,CNP刺激平滑肌細(xì)胞生成的PKGⅠα和PKGⅠβ的情況:利用共聚焦顯微鏡技術(shù)體外觀察5-HI、對(duì)于主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的收縮反應(yīng),并且觀察CNP在體外是否對(duì)5-羥色胺的收縮反應(yīng)有拮抗作用及其可能的機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 一、動(dòng)物模型部分
　　 各組大鼠右頸動(dòng)脈經(jīng)HE染色后普通光鏡下進(jìn)行觀察比較發(fā)現(xiàn),手術(shù)對(duì)照組出現(xiàn)明顯的病理改變:

12、血管包裹1周后血管口徑明顯變小,內(nèi)彈力板極度彎曲,中膜明顯增厚,外膜輕度增生,少量的炎細(xì)胞浸潤:同手術(shù)對(duì)照組相比,各個(gè)藥物干預(yù)組應(yīng)用2周均能明顯改善外膜慢性炎癥損傷部位的頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變。
　　 硅膠管包裹一周后,手術(shù)對(duì)照組右側(cè)頸動(dòng)脈基礎(chǔ)血流量(2.60±0.21ml/min)較正常組右頸動(dòng)脈明顯降低(3.49±0.11ml/min,p＜0.01),并且手術(shù)對(duì)照組右頸動(dòng)脈對(duì)血管局部應(yīng)用5-HT的收縮反應(yīng)性明顯增強(qiáng),局部滴注5-H

13、T后血流量變化率(38.22±3.10％)明顯高于正常組右頸動(dòng)脈(16.35±0.76％,p＜0.01);與正常組相比,各個(gè)藥物干預(yù)組的右頸動(dòng)脈基礎(chǔ)血流量及局部滴注5-HT后血流量變化率無明顯差異(p＞0.05);但同手術(shù)對(duì)照組相比,各個(gè)藥物干預(yù)組對(duì)右頸動(dòng)脈血流量及局部滴注5-HT后血流量變化率差異明顯(p＜0.01),同時(shí)發(fā)現(xiàn)低劑量通心絡(luò)組的血流變化率同阿托伐他汀組相似(p=0.625),而高劑量通心絡(luò)組的血流變化率同阿托伐他汀相比有

14、所減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.016)。
　　 硅膠管包裹大鼠右頸動(dòng)脈一周后,運(yùn)用elisa的方法測定各組血清中的CNP含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):雖然手術(shù)對(duì)照組大鼠血清中CNP的含量較正常組有所降低,同時(shí)各個(gè)藥物干預(yù)組同手術(shù)對(duì)照組相比,血清中CNP的含量均有增高趨勢,但是組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.089)。
　　 硅膠管包裹大鼠右頸動(dòng)脈一周后,運(yùn)用elisa的方法測定各組血管組織中的cGMP含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):對(duì)照組右頸動(dòng)脈同正常

15、組相比,血管組織中的cGMP表達(dá)下降且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);而通心絡(luò)各個(gè)劑量組和阿托伐他汀組右頸動(dòng)脈血管組織中的cGMP含量同對(duì)照組右頸動(dòng)脈相比明顯增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)通心絡(luò)組右頸動(dòng)脈血管組織中cGMP含量同阿托伐他汀組相比仍有增高且有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.000)
　　 硅膠管包裹大鼠右頸動(dòng)脈一周后,運(yùn)用Westen-blot方法測定各組右頸動(dòng)脈組織中CNP的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常組血管組織中有CN

16、P表達(dá),手術(shù)對(duì)照組右頸動(dòng)脈血管組織中的CNP表達(dá)較正常組減少約30％,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.016),而各個(gè)藥物干預(yù)組右頸動(dòng)脈血管組織中的CNP均有增高趨勢,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0＜0.05),同時(shí)發(fā)現(xiàn)右頸動(dòng)脈血管組織中CNP的表達(dá),低劑量通心絡(luò)組同阿托伐他汀組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.225),而高劑量通心絡(luò)組同阿托伐他汀組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.010)。
　　 硅膠管包裹大鼠右頸動(dòng)脈一周后,運(yùn)用Westen-blot方法測

17、定各組右頸動(dòng)脈組織中PKG I的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn):1、正常組血管組織中有PKGⅠα的表達(dá),手術(shù)對(duì)照組右頸動(dòng)脈血管組織中的PKGⅠα表達(dá)較正常組減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05),而各個(gè)藥物干預(yù)組血管組織中的PKGⅠα表達(dá)較手術(shù)對(duì)照組均明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)血管組織中PKG Iα的表達(dá),低劑量通心絡(luò)組同阿托伐他汀組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.310),而高劑量通心絡(luò)組同阿托伐他汀組相比有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.00

18、0);2、運(yùn)用Westen-blot方法測定血管組織中PKGⅠβ的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn):各組血管組織中均有PKGⅠβ的表達(dá),雖然對(duì)照組PKGⅠβ的表達(dá)較其它組有下降趨勢,但組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 二、細(xì)胞培養(yǎng)部分
　　 運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的方法,我們發(fā)現(xiàn):在不同濃度(10-5M～10-9M)時(shí),CNP刺激大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生成cGMP量均在10分鐘左右出現(xiàn)一個(gè)高峰,故細(xì)胞培養(yǎng)部分均采用中間

19、濃度(10-7M的CNP)和10分鐘這個(gè)時(shí)間點(diǎn)。
　　 運(yùn)用Westen-blot方法測定給予10-7M的CNP刺激后,大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(0,5,10,15,20,30分鐘)生成的PKG I情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):1、正常的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中有少量的PKGⅠα的表達(dá),加入CNP后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PKGⅠα的表達(dá)均明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);2、同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn),在正常的大鼠動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中也有少量的PKGⅠβ的表

20、達(dá),但是在加入CNP后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上PKGⅠβ的表達(dá)沒有明顯變化,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 運(yùn)用共聚焦顯微鏡技術(shù),我們發(fā)現(xiàn):①10-5M的5-HT后,細(xì)胞表面積(PCSA)明顯減小(大約減少34.04％±9.14％),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),表明5-HT在體外仍然有強(qiáng)烈的收縮平滑肌細(xì)胞的作用:②而在加入CNP(10-7M)之后再加入同樣濃度的5-HT,細(xì)胞表面積縮小程度明顯減輕,與加入5-HT之前相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)

21、差異(p＞0.05),表明CNP在體外有拮抗5-HT的收縮平滑肌細(xì)胞的作用;⑨最后在加入CNP和PKG I的阻斷劑KT-5823(2宰10-6M)后再加入同樣濃度的5-HT,細(xì)胞表面積又再次明顯縮小(大約減少33.24％±10.62％),CNP的抗5-HT的收縮作用被KT-5823所逆轉(zhuǎn),表明CNP抵抗5-HT的收縮作用主要與PKGⅠα有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、血管外膜慢性損傷早期階段可以引起血管慢性痙攣,血流量下

22、降,血管對(duì)5-HT的反應(yīng)敏感性增加,局部血管組織中CNP的蛋白表達(dá)下調(diào)是血管外膜慢性損傷引起血管收縮反應(yīng)性增強(qiáng)的重要機(jī)制之一;并且CNP的降低血管收縮反應(yīng)性的作用同局部血管組織中PKGⅠα的表達(dá)密切相關(guān),同局部血管組織中PKGⅠβ的表達(dá)關(guān)系不密切。
　　 2、應(yīng)用通心絡(luò)超微粉和阿托伐他汀一樣均能預(yù)防和改善血管外膜慢性損傷所致的血管慢性痙攣及血管對(duì)5-HT的高反應(yīng)性,這種作用主要通過上調(diào)局部血管組織中CNP的蛋白表達(dá)來發(fā)揮其緩解血