血管外膜源一氧化氮對AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及通絡(luò)藥物干預(yù)作用.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)以“營衛(wèi)承制調(diào)平”理論為指導(dǎo),結(jié)合西醫(yī)學(xué)近年研究揭示的血管外膜在血管病變中發(fā)揮的重要作用,從“營氣”與內(nèi)膜、“衛(wèi)氣”與外膜相關(guān)性為切入點(diǎn),通過建立內(nèi)外膜共孵育細(xì)胞模型,探討內(nèi)、外膜相互影響及通絡(luò)藥物干預(yù)血管病變中顯示的承、制、調(diào)、平規(guī)律,既是對中醫(yī)營衛(wèi)學(xué)說的傳承,又對更全面深刻的揭示血管病變發(fā)展演變的內(nèi)在機(jī)制具有指導(dǎo)意義。
　　 方法:
　　 1血管外膜源一氧化氮對AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

2、　　 1.1 AngⅡ?qū)w外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響
　　 常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304,選擇處于對數(shù)生長期融合良好的內(nèi)皮細(xì)胞,經(jīng)胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,接種于96孔板,待細(xì)胞融合致80％后,細(xì)胞隨機(jī)分為:(1)對照組:加入無血清DMEM培養(yǎng)基；(2)AngⅡ組:加入終濃度分別為10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/LAngⅡ。各組

3、分別繼續(xù)培養(yǎng)0h、6h、12h、24h、48h后,利用SRB法檢測各組細(xì)胞活力的變化。
　　 1.2 AngⅡ?qū)ρ芡饽ぴ碞O釋放的影響
　　 選取清潔級健康雄性SD大鼠,仔細(xì)分離并截取胸主動(dòng)脈,剝離外膜,并剪成2mmx2mm的組織薄片,吸干稱重,用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),24h后更換為無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,再加入終濃度為10-6mol/L的AngⅡ繼續(xù)培養(yǎng)1h、2h、12h、24h、48h,同

4、時(shí)設(shè)立空白對照組。硝酸還原酶法檢測各組培養(yǎng)上清液中NO含量,免疫印跡法檢測各組外膜iNOS蛋白表達(dá)水平。
　　 1.3外膜源NO對AngⅡ誘導(dǎo)的ECV304凋亡的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)分為5組:(1)單純內(nèi)皮細(xì)胞組:孵育的ECV-304細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)；(2)內(nèi)皮細(xì)胞+外膜組:內(nèi)皮細(xì)胞和外膜組織共孵育；(3)內(nèi)皮細(xì)胞+AngⅡ組:孵育的內(nèi)皮細(xì)胞中加入AngⅡ(終濃度為10-6mol/L)共孵育；(4)內(nèi)皮細(xì)胞+外膜+AngⅡ組

5、:于孵育的外膜中加入AngⅡ(終濃度為10-6mol/L),2h后把外膜和上清一并加入到內(nèi)皮細(xì)胞中繼續(xù)孵育24h；(5)內(nèi)皮細(xì)胞+L-NNA+外膜+AngⅡ組:外膜與NOS阻斷劑L-NNA(10-5mol/L)預(yù)孵育30min,PBS液洗滌3次,然后加入終濃度為10-6mol/L的AngⅡ預(yù)孵育,最后與內(nèi)皮細(xì)胞繼續(xù)孵育。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,HE染色觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,SRB法檢測細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,硝酸還原酶法間接檢測上

6、清一氧化氮水平,western blot法檢測各組細(xì)胞中eNOS蛋白表達(dá)水平
　　 2通絡(luò)藥物對AngⅡ誘導(dǎo)的外膜源一氧化氮的影響
　　 2.1通心絡(luò)對血管外膜源NO釋放的影響
　　 血管外膜的制備和培養(yǎng)同第一部分,然后分別加入終濃度為0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml的通心絡(luò)繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、2h、4h、6h、8h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集上清,離心后檢測

7、各組NO水平。
　　 2.2營衛(wèi)調(diào)節(jié)方對血管外膜源NO釋放的影響
　　 血管外膜的制備和培養(yǎng)同第一部分,然后分別加入終濃度為0％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％的營衛(wèi)調(diào)節(jié)方繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、2h、4h、6h、8h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集上清,離心后檢測各組NO水平。
　　 2.3通絡(luò)藥物對AngⅡ誘導(dǎo)的外膜源一氧化氮的影響
　　 外膜制備和培養(yǎng)同第一部分,然后分為8組:(1)單純外膜組:正常完

8、全培養(yǎng)基與外膜共孵育；(2)外膜+AngⅡ:孵育的外膜中加入AngⅡ(終濃度為10-6mol/L)共孵育；(3)外膜+通心絡(luò):孵育的外膜組織中加入通心絡(luò)(終濃度為50ug/ml)共孵育24h；(4)外膜+AngⅡ+通心絡(luò):AngⅡ與外膜預(yù)孵育,2h后加入通心絡(luò)繼續(xù)孵育24h；(5)外膜+L-NNA+AngⅡ+通心絡(luò):外膜與NOS阻斷劑L-NNA(10-5mol/L)預(yù)孵育30min,PBS液洗滌3次,然后加入終濃度為10-6mol/L的

9、AngⅡ預(yù)孵育,2h后加入通心絡(luò)繼續(xù)孵育24h；(6)外膜+營衛(wèi)調(diào)節(jié)方:孵育的外膜組織中加入營衛(wèi)調(diào)節(jié)方(終濃度為0.05％)共孵育；(7)外膜+AngⅡ+營衛(wèi)調(diào)節(jié)方:AngⅡ與外膜預(yù)孵育,2h后加入營衛(wèi)調(diào)節(jié)方繼續(xù)孵育24h；(8)外膜+L-NNA+AngⅡ+營衛(wèi)調(diào)節(jié)方組:外膜與NOS阻斷劑L-NNA(10-5mol/L)預(yù)孵育30min,PBS液洗滌3次,然后加入終濃度為10-6mol/L的AngⅡ預(yù)孵育,2h后加入營衛(wèi)調(diào)節(jié)方繼續(xù)孵育2

10、4h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后硝酸還原酶法間接檢測上清一氧化氮(NO),western blot法檢測各組中iNOS蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1本研究以“營衛(wèi)承制調(diào)平”理論為指導(dǎo),基于“營行脈中”、“衛(wèi)行脈外”,營衛(wèi)以血脈為界相偕而行,共同調(diào)節(jié)著脈絡(luò)舒縮功能及血液運(yùn)行的重要功能,結(jié)合西醫(yī)學(xué)揭示的血管外膜與內(nèi)皮在血管病變中發(fā)揮的重要作用,指出營氣與血管內(nèi)皮、衛(wèi)氣與血管外膜具有高度相關(guān)性,這對于從外膜與內(nèi)皮之間相互影響探討“脈絡(luò)一血

11、管系統(tǒng)病”發(fā)病機(jī)制,揭示“營衛(wèi)承制調(diào)平”理論在血管病變防治中的科學(xué)價(jià)值具有重要理論指導(dǎo)作用。
　　 2基于營氣與內(nèi)皮、衛(wèi)氣與外膜相關(guān)性,本研究以外膜與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育建立體外模型,探討外膜對AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示血管外膜可通過激活NOS/NO途徑抑制AngⅡ引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,不僅初步揭示了外膜在血管病變發(fā)生中的作用,也為探討中醫(yī)營衛(wèi)失和對“脈絡(luò)一血管系統(tǒng)病”的影響提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。
　　 3以絡(luò)

12、病理論為指導(dǎo)的通心絡(luò)和基于營衛(wèi)學(xué)說指導(dǎo)血管病變研制的營衛(wèi)調(diào)節(jié)方均能通過提高AngⅡ作用下外膜NO水平、增強(qiáng)iNOS蛋白表達(dá)保護(hù)血管內(nèi)皮,且通心絡(luò)作用優(yōu)于營衛(wèi)調(diào)節(jié)方,其機(jī)制與調(diào)節(jié)外膜NOS/NO系統(tǒng)有關(guān)。
　　 4本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:AngⅡ可使內(nèi)皮細(xì)胞損傷,NO分泌減少；加入外膜組織后,NO的分泌代償性增加,能夠拮抗AngⅡ引起的內(nèi)皮損傷；通絡(luò)藥物干預(yù)使外膜源NO的分泌明顯增加,從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。這體現(xiàn)了在內(nèi)外膜共孵育體系中“營衛(wèi)承