microRNA-24對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)調(diào)節(jié)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　為進(jìn)一步探討miRNA-24是否參與eNOS表達(dá)的調(diào)控及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，本研究構(gòu)建miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒，并用脂質(zhì)體將其導(dǎo)入人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)，觀察miRNA-24對(duì)eNOS表達(dá)及HUVECs增殖的影響并探討其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.miRNA-24對(duì)HUVECs增殖影響。
　　用

2、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒、空白質(zhì)粒、anti-miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入1640培養(yǎng)基孵育的HUVECs中，4h后更換含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在12h，24h，48 h，72 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞增殖數(shù)量;MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況;Griess法檢測(cè)培養(yǎng)上清的NO含量。
　　2.miRNA-24對(duì)eNOS表達(dá)的影響

3、r>　　用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒、空白質(zhì)粒、anti-miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入1640培養(yǎng)基孵育的HUVECs中，4h后更換含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)eNOS的mRNA表達(dá)情況;免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)eNOS蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　3.miRNA-24對(duì)SP-1表達(dá)的影響
　　用脂質(zhì)體Lipofec

4、tamineTM2000將miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒、空白質(zhì)粒、anti-miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入1640培養(yǎng)基孵育的HUVECs中，4h后更換含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。熒光定量PCR檢測(cè)SP-1的mRNA表達(dá)情況;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SP-1蛋白質(zhì)表達(dá)情況;Western blot法檢測(cè)SP-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　4.證實(shí)eNOS和SP-1是miRNA-24的靶基因
　　生物信息學(xué)結(jié)果顯示

5、，miR-24通過(guò)與eNOS和Sp-1的3'-UTR結(jié)合參與其表達(dá)的調(diào)控，我們分別構(gòu)建了包含eNOS-3'UTR和SP-1-3'UTR區(qū)野生型、突變型序列的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（pMIR-Report）并分別命名為pGL3-eNOS-wt,pGL3-eNOS-mut,pGL3-Sp1-wt, pGL3-Sp1-mut，將HUVECs種于24孔板中，用脂質(zhì)體作為載體將報(bào)告質(zhì)粒和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（海腎熒光素酶和miR-24或空白質(zhì)粒）一同轉(zhuǎn)染4

6、小時(shí)。熒光酶素的活性由雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組比較，miRNA-24高表達(dá)組細(xì)胞數(shù)目減少(P＜0.01)，增殖和遷移速度減慢(P＜0.05)，NO釋放也明顯減少(P＜0.01)。
　　2.與對(duì)照組比較，miRNA-24高表達(dá)組eNOS的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。
　　3.與對(duì)照組比較，miRNA-24高表達(dá)組SP-1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。

7、
　　4.與突變型報(bào)告質(zhì)粒相比較，野生型熒光酶素報(bào)告質(zhì)粒pGL3-eNOS-wt和pGL3-Sp-1-wt共轉(zhuǎn)染時(shí)miRNA-24可以顯著降低其活性(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.高表達(dá)miRNA-24可以抑制人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，減少細(xì)胞數(shù)量，減少人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成。
　　2.miRNA-24抑制HUVECs中eNOS的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，eNOS是HUVECs中miRNA-24的靶基因