microRNA-24對內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達調(diào)節(jié)和血管新生的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、背景：
　　microRNAs(miRNAs)是于2003年發(fā)現(xiàn)的一類長度約22堿基的短鏈寡核苷酸，其主要功能是通過序列特異性方式調(diào)節(jié)靶基因的表達。近年來資料表明，某些miRNAs參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)組織特異型基因表達，在VECs正常分化、增殖、凋亡和血管新生等生理過程中表達水平發(fā)生明顯改變，可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　血管新生(angiogenesis)主

2、要有兩個重要反應(yīng)，分別是新生血管形成(nascent angiogenesis)和血管生成(Vasculogenesis)，且均與VECs密切相關(guān)。血管新生作為正常生理過程參與多個器官穩(wěn)態(tài)的維持;近年來研究證實，其異常則與心血管疾病密切相關(guān)。
　　內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是血管內(nèi)皮組織特異型蛋白，其介導(dǎo)生成的一氧化氮(nitric oxide，NO)是維持血

3、管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，eNOS基因受內(nèi)含子源性27nt-miRNA和miRNA-21的調(diào)節(jié)，并且與核肌動蛋白和多種轉(zhuǎn)錄因子（例如Sp1）共同參與對VECs增殖和凋亡的調(diào)控。近來研究提示，miR-24對血管內(nèi)皮組織特異性基因表達的調(diào)控及其分子機制的研究甚少，對血管新生過程的影響尚未見報道。
　　我們新近發(fā)現(xiàn)，miR-24在心肌梗塞和高血壓病人血漿中有差異性表達，而這種改變可能涉及miR-24對VECs病理和生理

4、過程的調(diào)控。我們前期研究提示miR-24對內(nèi)皮細胞增殖的調(diào)控與其抑制eNOS和Sp1的表達有關(guān)。然而這一調(diào)節(jié)過程是否參與血管形成的調(diào)控和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。
　　目的：
　　研究miR-24對eNOS基因表達調(diào)節(jié)的分子機制及其對內(nèi)皮細胞增殖的影響;研究miR-24對內(nèi)皮細胞eNOS基因表達的分子調(diào)節(jié)機制及其對體外管腔形成的影響;進一步研究miR-24對內(nèi)皮細胞分化的分子調(diào)節(jié)機制及其對血管新生的影響;深入探討m

5、iR-24對心血管系統(tǒng)發(fā)育和心血管疾病發(fā)生發(fā)展的作用。
　　方法：
　　1檢測miR-24對人臍靜脈內(nèi)皮細胞eNOS和Sp1表達的影響
　　構(gòu)建miR-24及其反義序列的高表達質(zhì)粒，使用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical veinendothelial cells，HUVECs)分為:miR-24高表達組、miR-24干擾（anti-miR-24）

6、組和空白質(zhì)粒對照組。采用RT-PCR分別檢測eNOS和Sp1轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達水平;采用Western blotting分別檢測eNOS和Sp1轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達情況。
　　2檢測miR-24對HUVECs增殖、遷移和管腔形成的影響
　　構(gòu)建miR-24及其反義序列的高表達質(zhì)粒，使用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將HUVECs分為:miR-24高表達組、miR-24干擾(anti-miR-24)

7、組和空白質(zhì)粒對照組。于細胞轉(zhuǎn)染后的24、48和72 h三個時間點，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法分別檢測各組HUVECs增殖能力;采用Transwell試驗分別檢測各組細胞的遷移能力;采用人工基底膜（Matrigel）分別檢測各組細胞的成管能力。
　　3檢測miR-24對間充質(zhì)干細胞定向內(nèi)皮細胞分化的影響
　　構(gòu)建miR-24及其反義序列的高表達質(zhì)粒，使用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將人骨髓間充質(zhì)

8、干細胞（Human bone marrowmesenchymal stem cells，HBMSCs)分為:miR-24高表達組、miR-24干擾(anti-miR-24)組和空白質(zhì)粒對照組;采用VEGF和b-FGF聯(lián)合誘導(dǎo)方案，使HBMSCs定向內(nèi)皮細胞分化;鏡下觀察分化期間各組細胞形態(tài)學變化并拍照;采用硝酸還原酶法檢測分化期間第1、3、5、7、9天，5個時間點各組細胞液上清的NO濃度;采用免疫細胞化學分別檢測各組HBMSCs誘導(dǎo)分化

9、后eNOS和Sp1蛋白的表達情況;采用人工基底膜(Matrigel)分別檢測各組HBMSCs誘導(dǎo)分化后的成管能力。
　　4檢測miR-24對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響收集HBMSCs條件培養(yǎng)基;采用雞胚絨毛尿囊膜(chickenchorioallantoic membrane，CAM)模型分別檢測miR-24對血管形成的影響。
　　結(jié)果：
　　1與對照組比較，HUVECs miR-24高表達組eNOS和Sp1的mRN

10、A(P＜0.05)和蛋白表達明顯減少(P＜0.05)。
　　2與對照組比較，miR-24高表達組細胞增殖明顯降低(P＜0.05)，遷移數(shù)目降低(P＜0.05)，且未能形成明顯管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　3與對照組比較，miR-24高表達組HBMSCs未見內(nèi)皮樣形態(tài)，分化期間培養(yǎng)液上清NO濃度明顯降低(P＜0.05)，誘導(dǎo)分化后HBMSCs eNOS和Sp1的熒光強度明顯降低，且未能形成明顯管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　4與對照組比較，miR

11、-24高表達組CAM血管新生數(shù)目明顯降低(P＜0.05)，血管新生面積比率降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1 miR-24顯著抑制HUVECs eNOS mRNA和蛋白質(zhì)的表達，核轉(zhuǎn)錄因子Sp1的參與可能是這一調(diào)節(jié)過程的重要分子機制之一。
　　2 miR-24顯著抑制HUVECs的增殖、遷移和體外管腔形成能力，并且與其調(diào)控eNOS的表達有關(guān)。
　　3 miR-24顯著抑制HBMSCs定向內(nèi)皮細胞分化及誘導(dǎo)