γ-氨基丁酸對(duì)情緒應(yīng)激大鼠額葉皮質(zhì)一氧化氮合酶和一氧化氮水平的影響

1、<p>　　γ-氨基丁酸對(duì)情緒應(yīng)激大鼠額葉皮質(zhì)一氧化氮合酶和一氧化氮水平的影響</p><p>　　歐陽(yáng)俊彥，胡卓炎，褚玥，梁添，賴(lài)玉婷，羿利華，柳春紅（510642 廣州，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）</p><p>　　[摘要] 目的 觀察γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)情緒應(yīng)激大鼠一氧化氮合酶（NOS）和一氧化氮（NO）含量的影響，結(jié)合行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，探討

2、γ-氨基丁酸抗焦慮作用機(jī)理。方法 將40只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為五個(gè)組：定時(shí)飲水組（C）、情緒應(yīng)激組（E）、0.5 mg/kg GABA劑量組（L）、1 mg/kg GABA劑量組（M）和2 mg/kg GABA劑量組（H），采用不確定性空瓶刺激的方法建立焦慮大鼠模型，并在應(yīng)激前分別給予大鼠灌服生理鹽水或相應(yīng)劑量的GABA，14 d后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)并分析各組大鼠額葉皮質(zhì)一氧化氮合酶和一氧化氮水平的差異。結(jié)果

3、 應(yīng)激14 d后C組與其余各組的食物利用率差異極顯著（P＜0.01）；各組大鼠在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間差異極為顯著（p＜0.01）；C組、M組和H組進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)顯著高于E組（P＜0.05）；E組的修飾次數(shù)顯著高于M組和H組（P＜0.05）；總運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；對(duì)大鼠額葉皮質(zhì)NOS及NO的分析顯示C組和H組的NOS活力及NO含量顯著高于E組（P＜0.05）。結(jié)論 GABA與焦慮大鼠額葉皮</p&

4、gt;<p>　　關(guān)鍵詞：γ-氨基丁酸；焦慮；一氧化氮合酶；一氧化氮；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)</p><p>　　[中圖分類(lèi)號(hào)] R749.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A </p><p>　　Modulation of emotional stress-induced NOS and NO changes in frontal cortex by 4-aminobutyric acid i

5、n rats</p><p>　　OuYang Junyan, Hu Zhuoyan, Chu Yue, Liang Tian, Lai Yuting, Yi Lihua, Liu Chunhong（College of Food Science，South China Agricultural University，The Key Laboratory of Food Quality and Safety，Gu

6、angzhou，510642，China）</p><p>　　[Abstract] Objective To observe the effect of 4-aminobutyric acid(GABA) on NOS activity and NO levels combining behavioral test of rats exposed to emotional stress, and explo

7、re its anti-anxiety mechanisms. Method Utilizing the rat model of emotional stress induced by empty water bottles, 40 male Sprague-Dawley rats were divided into 5 groups randomly(n=8 each), control group(C), emotional s

8、tress group(E), 0.5 mg/kg GABA group(L), 1 mg/kg GABA group(M) and 2 mg/kg GABA group(H). Rats were pret</p><p>　　[Keywords] 4-aminobutyric acid; anxiety; NOS; NO; open field test</p><p>　　Supp

9、orted by the earmarked fund for Modern Agro-industry Technology Research System（CARS-33). Corresponding author: Liu Chunhong, E-mail: liuch@scau.edu.cn</p><p>　　[基金項(xiàng)目] 國(guó)家荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-33)</p><p&

10、gt;　　[通訊作者] 柳春紅，Email: liuch@scau.edu.cn</p><p>　　γ-氨基丁酸 (γ-Aminobutyric acid，GABA)又稱(chēng)γ-氨酪酸，作為一種非蛋白質(zhì)天然氨基酸，廣泛分布在動(dòng)物、植物和微生物體中，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、改善腎功能和鎮(zhèn)靜等生理作用[1]。</p><p>　　NO在神經(jīng)系統(tǒng)中起著信

11、使分子的作用，廣泛參加了生物體內(nèi)的各種病理和生理過(guò)程[2]，它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中各種神經(jīng)遞質(zhì)之間的關(guān)系也越來(lái)越受關(guān)注。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)NO與焦慮密切相關(guān)，但結(jié)果并不一致[3-5]。此外，目前大部分的研究都集中在急性應(yīng)激模型中，慢性應(yīng)激模型中也往往采用包含軀體應(yīng)激成分的模型如束縛應(yīng)激、條件性電擊及慢性溫和應(yīng)激（CMS）等[6-8]，不能很好地模擬人類(lèi)由情緒應(yīng)激引起的焦慮癥狀，而有關(guān)GABA與NO之間的關(guān)系與機(jī)制研究國(guó)內(nèi)更是少見(jiàn)報(bào)道。在中樞神

12、經(jīng)系統(tǒng)中，額葉皮質(zhì)是與情緒密切相關(guān)的重要區(qū)域，所以本研究通過(guò)建立不確定性空瓶刺激模型，結(jié)合大鼠額葉皮質(zhì)NO的變化，探討GABA對(duì)慢性情緒應(yīng)激大鼠的抗焦慮作用機(jī)制。</p><p><b>　　1 材料和方法</b></p><p><b>　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物</b></p><p>　　健康雄性 Sprague-Da

13、wley 大鼠40只，體重 150~170 g。動(dòng)物及其飼料均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。大鼠單籠喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)7天，光/暗周期為12h/12h(光照時(shí)間為07：00~19：00)，室內(nèi)溫度為(22±0.5℃)，濕度為50%左右。適應(yīng)期內(nèi)所有動(dòng)物自由攝食和飲水。 </p><p>　　1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備</p><p>

14、;　　GABA（純度＞99%）購(gòu)自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）及考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。所用儀器包括：動(dòng)物行為軌跡跟蹤系統(tǒng)EthoVision XT 8.0（荷蘭Noldus公司）；手動(dòng)勻漿器；Eppendorf 5417R小型臺(tái)式高速離心機(jī)；HH-W21-600型電熱恒溫水溫箱；METTLER TOLEDO EL2001電子天平；日立U3010型紫外分光光度儀。</p>

15、;<p><b>　　1.3 實(shí)驗(yàn)程序</b></p><p>　　大鼠適應(yīng)一周后按照體重編號(hào)隨機(jī)分為五組：定時(shí)飲水組（C），情緒應(yīng)激組(E)，0.5 mg/kg GABA劑量組（L）、1 mg/kg GABA劑量組（M）和2 mg/kg GABA劑量組（H）。分別對(duì)五組動(dòng)物進(jìn)行定時(shí)喂水訓(xùn)練7天，定時(shí)喂水訓(xùn)練為每日2次，即每天早上9：00~9：10和晚上9：00~9：10給動(dòng)

16、物飲水，之后撤掉水瓶，其余時(shí)間不給水。每天定時(shí)喂水1 h前，C組和E組給予大鼠灌服生理鹽水，各個(gè)GABA劑量組則灌服對(duì)應(yīng)劑量的GABA溶液。定時(shí)喂水期結(jié)束后開(kāi)始應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，情緒應(yīng)激組在定時(shí)喂水時(shí)間內(nèi)給予空瓶刺激誘發(fā)其情緒應(yīng)激，刺激是早上9：00~9：10或晚上9：00~9：10隨機(jī)給予的，維持一天一次；各個(gè)GABA劑量組與情緒應(yīng)激組相仿；定時(shí)飲水組動(dòng)物一直定時(shí)飲水，應(yīng)激共持續(xù)14天。所有動(dòng)物在適應(yīng)期末和應(yīng)激期末測(cè)量體重及進(jìn)食量，計(jì)算食物利

17、用率，食物利用率為每消耗100 g飼料所增加的體重克數(shù)。行為學(xué)測(cè)試前一周所有動(dòng)物每天接受3 min撫摸以減少無(wú)關(guān)刺激，應(yīng)激結(jié)束后進(jìn)行曠場(chǎng)行為學(xué)測(cè)定。</p><p>　　1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open field test）</p><p>　　實(shí)驗(yàn)裝置為高50 cm、底邊長(zhǎng)50 cm的無(wú)蓋方箱，中央畫(huà)有長(zhǎng)×寬為30 cm×30 cm的方格，方格內(nèi)所包含的區(qū)域?yàn)橹醒雲(yún)^(qū)域，

18、沿墻格的為外周區(qū)域。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均提前1 h進(jìn)入測(cè)試實(shí)驗(yàn)室以適應(yīng)環(huán)境。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室保持安靜通風(fēng)，曠場(chǎng)分析箱上方掛一40W的白熾燈并保持恒亮，室溫22℃。將大鼠置于方形曠場(chǎng)的外周區(qū)域，通過(guò)曠場(chǎng)上方的攝像機(jī)及與隔壁相連的監(jiān)視器和錄像機(jī)觀察5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。分別記錄大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)、總運(yùn)動(dòng)距離、直立次數(shù)（后肢站立）以及修飾次數(shù)（梳理皮毛和洗臉）。每次觀察完成后將動(dòng)物排泄物清除干凈，并用75%的酒精徹底清洗

19、曠場(chǎng)并擦干。</p><p>　　1.5 NO及NOS的測(cè)定</p><p>　　行為學(xué)測(cè)試完畢后，各組大鼠斷頭取腦，在冰面上分離大腦額葉皮層，置于-80℃冰箱中待測(cè)。使用前用預(yù)冷的生理鹽水沖洗腦組織以去除血跡，濾紙拭干，分析天平稱(chēng)重，用生理鹽水在冰浴中制成10%的勻漿，冷凍離心機(jī)500 g4℃下離心10 min，取上清液待測(cè)。NO的檢測(cè)采用硝酸還原酶法，利用硝酸還原酶特異性將硝酸根還原

20、為亞硝酸根，通過(guò)顯色深淺測(cè)定其濃度。NOS能催化L-精氨酸（L-Arg）和分子氧生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，根據(jù)吸光度大小可確定NOS活力。樣品的蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。</p><p>　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法</p><p>　　采用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，單因素方差分析（one w

21、ay analysis of variance, ANOVA）進(jìn)行處理，以p＜0.05為差異顯著，進(jìn)一步post-hoc分析兩組間差異采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)（SNK法），p＜0.05為差異顯著。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p><b>　　2.1 體重變化</b></p>

22、<p>　　建模前后五組動(dòng)物的體重增長(zhǎng)量總體比較差異極為顯著（P＜0.01），C組體重增加顯著高于其余各組（P＜0.01）；各組大鼠的進(jìn)食量比較差異顯著（P＜0.05），E組的進(jìn)食量顯著低于其余各組（P＜0.01）；各組大鼠的食物利用率總體比較差異極顯著（P＜0.01），C組的食物利用率高于其余各組（P＜0.01），食物利用率隨著GABA劑量的增加而有所下降。結(jié)果見(jiàn)表1。</p><p>　　表1

23、 建模前后各組大鼠體重的差異比較（g，M±SD，n=8）</p><p>　　注：a表示與C組比較，P＜0.01</p><p>　　2.2 曠場(chǎng)行為的變化</p><p>　　建模后E組較C組在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間明顯減少，與M組，H組差異極為顯著（P＜0.01），隨著GABA劑量的增加，動(dòng)物在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間相應(yīng)增加。同時(shí)，E組較C組進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)

24、也明顯減少，與M組，H組差異顯著（P＜0.05），隨著GABA劑量的增加，動(dòng)物進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)亦相應(yīng)增加。各組動(dòng)物的總運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。E組的修飾次數(shù)顯著高于M組和H組（P＜0.01），隨GABA劑量的遞增動(dòng)物的修飾次數(shù)呈下降趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表2。</p><p>　　表2 建模后各組大鼠曠場(chǎng)行為指標(biāo)的差異比較（M±SD，n=8）</p><p>　

25、　注：a表示與E組比較，P＜0.05；b表示與E組比較，P＜0.01</p><p>　　2.3 NOS及NO含量的變化</p><p>　　建模后各組大鼠間額葉皮質(zhì)NOS活力差異顯著（P＜0.05），進(jìn)一步用SNK法進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示E組的NOS活力顯著低于C組和H組（P＜0.05）；各組大鼠之間NO含量差異顯著（P＜0.05），進(jìn)一步的多重比較顯示E組的NO含量顯著低于C組和H組

26、（P＜0.05）。隨著GABA劑量的增加大鼠的NOS活力和NO含量均呈上升趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖2。</p><p>　　圖1 各組大鼠額葉皮質(zhì)的NOS活力 圖2 各組大鼠額葉皮質(zhì)的NO濃度</p><p>　　注：a表示與E組比較，P＜0.05</p><p><b>　　3 討論</b>

27、</p><p>　　本研究采用不確定性空瓶刺激建立慢性應(yīng)激焦慮大鼠模型，此模型能夠誘發(fā)動(dòng)物攻擊、咬瓶子、頻繁修飾等焦慮行為。以往大多數(shù)研究所采用的應(yīng)激源都摻雜了生理因素的影響，而此應(yīng)激模型不含電擊等物理應(yīng)激成分，因此，能很好地模擬人類(lèi)在單純情緒應(yīng)激下的焦慮行為和生理反應(yīng)[9]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的焦慮動(dòng)物模型，其原理是利用了動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的恐懼心理和探究特性形成的矛盾沖突來(lái)考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)。周邊區(qū)域?qū)?dòng)物來(lái)說(shuō)相對(duì)

28、安全，而探究的天性又促使其進(jìn)入中央?yún)^(qū)域活動(dòng)，因此，焦慮水平高的動(dòng)物傾向于停留在周邊區(qū)域，反之，中央?yún)^(qū)域的探究次數(shù)和時(shí)間越多，焦慮水平則越低[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，情緒應(yīng)激組的大鼠在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)顯著下降，表現(xiàn)出明顯的焦慮癥狀，提示造模成功。</p><p>　　GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦皮質(zhì)、丘腦、海馬等多個(gè)部位發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，焦慮癥與GABA能神經(jīng)系統(tǒng)功能的失調(diào)密

29、切相關(guān)。一般認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的GABA作用于GABAA受體，通過(guò)改變神經(jīng)細(xì)胞膜的氯離子的通透性達(dá)到抑制突觸后電位，從而抑制焦慮狀態(tài)下的神經(jīng)細(xì)胞活性的作用[13]。然而，由于外源性GABA對(duì)血腦屏障的透過(guò)率很低[14]，口服GABA的抗焦慮效果一直存有疑問(wèn)。周春英等人的研究顯示GABA能改善慢性應(yīng)激抑郁大鼠的認(rèn)知功能[15]；KANEHIRA等人研究發(fā)現(xiàn)給予健康受試者服用含50 mg GABA的飲料250 ml，能有效減輕受試者的身心疲

30、勞并提高其完成任務(wù)的效率，但其作用機(jī)制并不明確[16]。本實(shí)驗(yàn)中給予應(yīng)激大鼠服用GABA后，三個(gè)劑量組都在沒(méi)有改變大鼠活動(dòng)性的前提下不同程度地增加了動(dòng)物的中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，提示GABA在此模型上具有抗焦慮作用。此外，直立次數(shù)與修飾次數(shù)作為曠場(chǎng)行為的指標(biāo)，同樣能反映動(dòng)物的情緒狀態(tài)，直立行為的減少與頻繁的修飾行為，往往暗示焦慮水平更高[17, 18]。M組和H組大鼠的修飾行為較E組顯著下降，提示</p&g

31、t;<p>　　以往的研究表明，海馬和前腦是應(yīng)激所涉及的關(guān)鍵腦區(qū)。海馬雖然對(duì)應(yīng)激很敏感，但同時(shí)也具有較強(qiáng)的修復(fù)能力，而前腦在應(yīng)激時(shí)的代償能力較差，也有研究證明，額葉皮質(zhì)與情緒的關(guān)系密切[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性情緒應(yīng)激組的NOS活力及NO含量顯著下降，與定時(shí)飲水組及GABA 2 mg/kg組差異顯著，這與Masood[23]等的研究結(jié)果一致。NO是一種廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氣體分子，是信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)傳遞的重要信使。NOS

32、作為NO的合成酶，主要分布在與焦慮緊密相關(guān)的腦區(qū)如海馬、額葉和下丘腦等。有研究顯示，給予大鼠注射不同劑量的L-精氨酸（一氧化氮合酶抑制劑），大鼠在明暗穿箱實(shí)驗(yàn)及孔板實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出不同程度的焦慮[24]，由此推測(cè)NO水平的下降與焦慮的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)中，隨著GABA灌胃劑量的上升，NOS活力及NO含量相應(yīng)增加，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，提示GABA可能通過(guò)上調(diào)NO水平發(fā)揮其抗焦慮作用。Gilhotra[25]等人的研究表明焦慮大鼠腦中的GABA含

33、量顯著下降，而GABA和地西泮均能提高腦中NO的含量，相對(duì)地，NO水平的上升同樣能增加GABA的含量[26]。目前已有研究顯示在大鼠蒼白球中NO能拮抗</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Lee B, Kim J, Kang Y M, et al. Antioxidant activity and γ-aminobutyric a

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