一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染小鼠內(nèi)皮祖細胞實驗研究.pdf

1、目的:探討小鼠骨髓來源的血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的體外培養(yǎng)、誘導分化及表面標志物的鑒別。探討利用脂質(zhì)體介導內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞(EPC)的可行性。
　　方法:收集ICR小鼠骨髓EPCs，F(xiàn)icoll分離單核細胞，使用含有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在細胞培養(yǎng)5、10、15及20d

2、后檢測細胞表面的內(nèi)皮細胞標志物。構(gòu)建、擴增、提取并純化pcDNA3.0/eNOS基因質(zhì)粒;用EPC培養(yǎng)基配成2×105·mL細胞懸液按0.6mL/孔重新鋪6孔板，待細胞生長至80％左右融合時，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000體外轉(zhuǎn)染eNOS基因至EPC。轉(zhuǎn)染48h后，采用RT-PCR檢測EPC中eNOS的表達，硝酸還原酶法檢測EPC中一氧化氮(NO)的含量，熒光探針DCFH-DA活性氧檢測氧自由基(ROS)的含量。

3、　　結(jié)果:培養(yǎng)5d后細胞開始出現(xiàn)上皮細胞的形態(tài)，有偽足出現(xiàn);培養(yǎng)10d，細胞開始增殖，成圓形，出現(xiàn)梭形細胞;培養(yǎng)15d，細胞出現(xiàn)較為典型的內(nèi)皮細胞形態(tài)，鋪路石狀;培養(yǎng)20 d，細胞出現(xiàn)長梭形拉網(wǎng)狀，即類似成熟內(nèi)皮細胞形態(tài)。免疫熒光染色及流式定量檢測結(jié)果顯示，CD34在EPCs中的表達水平隨培養(yǎng)時間延長有漸變減弱的趨勢;VEGFR-2在EPCs的表達水平隨培養(yǎng)時間延長有漸變增強的趨勢。成功構(gòu)建pcDNA3.0/eNOS基因載體。轉(zhuǎn)染48