基因芯片技術(shù)篩選不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、目的：利用基因芯片技術(shù)篩選不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞差異表達(dá)基因，分析不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞基因表達(dá)變化的特征及其可能的生物學(xué)意義，為進(jìn)一步探討表皮干細(xì)胞增殖分化調(diào)控機(jī)制提供新思路和線(xiàn)索。 方法：收集28～32周胎兒，4～12周歲少兒、35～55歲成年人3組正常人皮膚標(biāo)本，采用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮，Ⅳ型膠原快速粘附法分離、純化人表皮干細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分別行β1整合素、K19單抗檢測(cè)鑒定。將21522條Ol

2、igo DNA用點(diǎn)樣儀點(diǎn)制在一張經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的載玻片上制備成表達(dá)譜芯片。按Trizol一步法分別提取各組細(xì)胞總RNA，瓊脂糖甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄方法將Cy3熒光標(biāo)記到Human對(duì)照組DNA上（以人類(lèi)基因作為共同參照），將Cy5熒光標(biāo)記到實(shí)驗(yàn)組（胎兒組、少兒組與成人組）cDNA上，制成探針，并與表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交及掃描芯片熒光信號(hào)圖像。采用LuxScan3.0圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，以2倍差異表

3、達(dá)值（Ratio）篩選差異表達(dá)基因。選擇明顯上調(diào)或抑制的基因，用Real time RT-PCR技術(shù)對(duì)相關(guān)的基因作進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)果：基因芯片高通量地揭示了胎兒、少兒和成人組表皮干細(xì)胞的遺傳信息。成人組與少兒組樣本相比，差異表達(dá)基因有1808條，其中上調(diào)的基因有1089條，下調(diào)的基因有719條；已知基因1462條（已在Gene Bank登錄），未知基因346條。少兒與胎兒組樣本相比，差異表達(dá)基因有4534條，其中上調(diào)的基因有17

4、83條，下調(diào)的基因有2751條；已知基因3577條（已在Gene Bank登錄），未知基因957條。對(duì)篩選出的成人與少兒，少兒與胎兒的差異表達(dá)基因結(jié)果在Molecu-le Annotation System進(jìn)行了Go分類(lèi)的統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)基因功能分類(lèi)，成人與少兒差異表達(dá)基因可分為128類(lèi)，少兒與胎兒差異表達(dá)基因可分為216類(lèi)，因一個(gè)基因可以有多個(gè)功能，其總數(shù)大于篩選出的差異基因總和。其中1104條基因在胎兒、少兒與成人組樣本中呈持續(xù)差異表

5、達(dá)，根據(jù)基因功能分為32類(lèi)。差異基因涉及蛋白質(zhì)翻譯、能量合成和DNA復(fù)制，均與表皮干細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到持續(xù)差異表達(dá)基因中有94條基因表達(dá)差異呈持續(xù)上調(diào)，75條表達(dá)差異呈持續(xù)下調(diào)。表達(dá)持續(xù)上調(diào)的基因類(lèi)別主要為核苷酸結(jié)合蛋白基因（如NM_005381、NM_024045）、蛋白質(zhì)折疊結(jié)合相關(guān)基因（如NM_002157、NM_006260）、鋅離子結(jié)合蛋白基因和ATP結(jié)合蛋白基因等。表達(dá)持續(xù)下調(diào)的基因類(lèi)別主要為GTP結(jié)合蛋白基

6、因、序列特異性DNA結(jié)合蛋白基因（如NM_005253、NM_001421）、促分裂原活化蛋白激酶基因（如NM_002746、NM_002754）、核仁蛋白家族基因和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白基因等。Real time RT-PCR結(jié)果顯示胎兒、少兒與成人樣本中TUBGCP3表達(dá)量持續(xù)增高，而FOSL2的表達(dá)量持續(xù)降低，與芯片篩選結(jié)果相一致，說(shuō)明本次基因芯片篩查結(jié)果真實(shí)、可靠。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的胎兒、少兒與成人表皮干細(xì)胞基因表達(dá)譜有明顯