雞柔嫩艾美耳球蟲表達(dá)序列標(biāo)簽和不同發(fā)育階段基因表達(dá)譜分析.pdf

1、雞球蟲屬于具有頂復(fù)合器的原生動(dòng)物，寄生于雞的腸上皮細(xì)胞內(nèi)，常常引起大批雞只的死亡，因此雞球蟲病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害是巨大的。本文用球蟲的四個(gè)發(fā)育階段的樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后分別與cDNA陣列進(jìn)行雜交，分析了在不同發(fā)育階段中基因的表達(dá)情況，篩選出一些與發(fā)育相關(guān)的基因。 以柔嫩艾美耳球蟲敏感株和抗馬杜霉素株(由敏感株誘導(dǎo))各四個(gè)發(fā)育階段即未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子為材料，構(gòu)建了具有不同發(fā)育階段和具有不同表型的混合cDNA文庫。根據(jù)細(xì)

2、菌計(jì)數(shù)法推斷cDNA文庫濃度約為1.83×10<'5>個(gè)細(xì)菌/ml。文庫細(xì)菌培養(yǎng)液均勻涂布于麥康凱平板上，檢測(cè)重組率約為80％。對(duì)隨機(jī)挑選的200個(gè)cDNA克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得137個(gè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)插入片段的大小，文庫隨機(jī)插入外源cDNA片段的平均長(zhǎng)度約為1Kb。根據(jù)對(duì)文庫的質(zhì)量鑒定，能夠滿足后續(xù)分析的需要。 從這個(gè)混合文庫中隨機(jī)挑取9600個(gè)克隆進(jìn)行大規(guī)模3’端測(cè)序，經(jīng)生物信息學(xué)分析，獲得2806條3

3、’端高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)，拼接出1424個(gè)假定獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本(TUTS)。與UniProt數(shù)據(jù)庫的BLASTx結(jié)果顯示：共1191個(gè)TUTs沒有明顯同源性而被鑒定為未知基因，約占總TUTs總數(shù)的83.6％。文庫1424個(gè)TUTs的BLASTn比對(duì)結(jié)果表明：約83.2％獨(dú)立基因(TUTs)與雞柔嫩艾美耳球蟲Houghton株基因組序列有同源性匹配(E value<10<'-5>)。根據(jù)與GenBank中dbEST數(shù)據(jù)庫中柔嫩艾美耳

4、球蟲的EST序列進(jìn)行比對(duì)獲得了811個(gè)TUTS做為文庫的特有基因；共有84個(gè)TUTS與剛地弓形體的獨(dú)立基因具有同源性匹配(E值≤10<'-5>)。 在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子發(fā)育時(shí)期，共鑒定出484個(gè)特異表達(dá)的基因(P<0.01，倍數(shù)變化>2)。熒光定量PCR分析驗(yàn)證了cDNA陣列數(shù)據(jù)的可靠性。經(jīng)過對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)譜分析，在未孢子化卵囊階段和孢子化卵囊階段的代謝水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于子孢子階段和裂殖子階段?？梢酝?/p>