柔嫩艾美耳球蟲3個(gè)發(fā)育相關(guān)基因的研究.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于腸道所引起的一種危害極其嚴(yán)重的寄生蟲病,嚴(yán)重影響家禽的生長(zhǎng)發(fā)育,全世界每年因球蟲病造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,雞球蟲病的防治主要以藥物防治為主,但隨著球蟲抗藥性的出現(xiàn)及藥物殘留等問題的出現(xiàn),迫使人們?nèi)ふ腋行У姆乐畏椒??；蚬こ桃呙绯蔀檠芯康臒狳c(diǎn),而尋找理想的蟲體抗原是基因工程疫苗研究的最大難點(diǎn)。
　　 1.柔嫩艾美耳球蟲BW4-C03、BW1-E03基因cDNA全長(zhǎng)克隆分析及BW4-C03基因的原核

2、表達(dá)為尋找與雞球蟲發(fā)育、入侵相關(guān)的作用分子,本實(shí)驗(yàn)室利用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)和cDNA微陣列技術(shù)篩選獲得了柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)不同發(fā)育階段的ESTs序列。本研究選擇2個(gè)孢子化卵囊階段高表達(dá)的EST片段,其克隆號(hào)為BW4-C03、BW1-E03,利用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到含完整開放閱讀框(ORF)的基因cDNA全長(zhǎng)序列。經(jīng)同源性比對(duì),BW4-C03與柔嫩艾美耳球蟲mRNA表面抗原23(EtmRNA-SAG

3、23)和表面抗原21(EtmRNA-SAG21)均有82％同源性,其編碼的蛋白與柔嫩艾美耳球蟲表面抗原19(EtSAG19)和表面抗原20(EtSAG20)分別有75％和72％同源性,推測(cè)該蛋白屬于柔嫩艾美耳球蟲表面抗原,命名為EtSAG。Bw1-E03與柔嫩艾美耳球蟲mRNA表面抗原13同源性達(dá)100％,命名為EtSAG13。此外,利用生物信息學(xué)軟件對(duì)這兩個(gè)基因的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、抗原位點(diǎn)、保守結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析

4、。Real-time PCR檢測(cè)2個(gè)基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、裂殖子4個(gè)發(fā)育階段和不同孢子化時(shí)間(6 h、12 h、20 h、30 h、48 h)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示BW4-C03和BW1-E03都為孢子化卵囊高表達(dá)基因,在培養(yǎng)孢子化48 h的轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)最高。進(jìn)一步構(gòu)建了EtSAG的原核表達(dá)重組質(zhì)粒(pET-28C-EtSAG),獲得重組蛋白經(jīng)Western—blot檢測(cè)具有良好的免疫原性。
　　 2.柔嫩艾美耳球

5、蟲ZB10-E05基因的克隆表達(dá)及特性分析本研究選取子孢子階段高表達(dá)的EST片段,克隆號(hào)為ZB10-E05,利用RACE技術(shù)獲得含ORF的基因cDNA全長(zhǎng)序列。經(jīng)同源性比對(duì),其編碼的蛋白與剛地弓形蟲的核酸內(nèi)切酶／核酸外切酶有46％同源性,未見與球蟲同源性的數(shù)據(jù),提示該基因可能是雞球蟲中未報(bào)道的新基因。進(jìn)一步構(gòu)建該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒(PGEX-4T-2-E05),獲得原核表達(dá)產(chǎn)物,命名為GST-E05,經(jīng)Western-blot檢測(cè)顯示該

6、蛋白具有良好的免疫原性。
　　 本研究對(duì)ZB10-E05基因表達(dá)蛋白(GST-E05)的功能進(jìn)行了初步研究。將重組蛋白GST-E05免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,利用間接免疫熒光試驗(yàn)分析目的蛋白在柔嫩艾美耳球蟲子孢子體外接種雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1細(xì)胞)后不同發(fā)育階段蟲體的定位分布情況。結(jié)果顯示,入侵初始階段目的蛋白主要分布在蟲體的頂端及中部；子孢子入侵48 h,可以看到該蛋白主要位于帶蟲空泡,且蟲體入侵24～48 h蛋白的表

7、達(dá)量明顯高于其它階段,推測(cè)該蛋白與子孢子入侵宿主細(xì)胞有關(guān)。為了驗(yàn)證該蛋白是否與子孢子入侵有關(guān),利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行了體外抑制實(shí)驗(yàn)。將純化后的多抗1gG按50μg／mL、100μg／mL、200μg／mL、400μg／mL分別與子孢子孵育2 h后接入DF—1細(xì)胞,結(jié)果顯示隨著抗體濃度的升高,子孢了進(jìn)入宿主細(xì)胞的入侵率也逐漸降低,說明該蛋白與子孢子的入侵相關(guān)。
　　 3.重組蛋白GST-E05對(duì)雞球蟲免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)為了分析重組蛋白GST

8、-E05的免疫保護(hù)效果,將重組表達(dá)蛋白GST-E05分別以50μg／只、100μg／只2次肌肉注射免疫雛雞,最后一次免疫后7 d用柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊1×104攻擊,通過盲腸病變記分、相對(duì)增重、卵囊減少率、細(xì)胞免疫水平和體液免疫水平等指標(biāo),對(duì)其免疫保護(hù)效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示在增重、卵囊減少率及盲腸病變記分方面,免疫組均好于感染不免疫對(duì)照組,且高劑量(100μg／只)免疫組的保護(hù)效果總體好于低劑量免疫組(50μg／只)。雞體在一免