柔嫩艾美耳球蟲抗藥性蟲體純化及mRNA差異顯示的研究.pdf

1、球蟲病是集約化的養(yǎng)雞場的危害最大的疫病之一,目前其防治仍不能離開抗球蟲藥,但藥物使用過程中不可避免的會產(chǎn)生抗藥性,因此,我們選擇抗藥性這個球蟲病防治中的重要課題進(jìn)行研究,采用玻璃紙法進(jìn)行了柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的單卵囊感染和單孢子囊克隆,采用過濾、離心分離和DE-52纖維素柱層析系列方法純化了不同蟲株球蟲的裂殖子,對不同蟲株的裂殖子進(jìn)行了mRNA差異顯示,進(jìn)行了實驗室球蟲抗藥性分子檢測方法的初步應(yīng)用.單卵囊純化

2、和單孢子囊克隆.用單卵囊感染技術(shù),對柔嫩艾美耳球蟲卵囊進(jìn)行了分離純化,實驗室單卵囊感染26只雞,飽和鹽水漂浮集卵法進(jìn)行檢測,成功率達(dá)38﹪;首次采用單孢子囊克隆技術(shù),在國內(nèi)對柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行了克隆,單孢子囊感染35只雞,10只雞感染成功,成功率28.6﹪.結(jié)果獲得了遺傳上單一的上海馬杜霉素敏感和抗藥蟲株,甘肅地克珠利敏感和抗藥的蟲株,該單卵囊分離純化和單孢子囊克隆技術(shù)簡單易行.不同蟲株的裂殖子的分離純化.12日齡 的肉用雛雞,感染1.

3、5×10<'5>個卵囊,采用標(biāo)準(zhǔn)分樣篩過濾、離心分離和DEAE-52纖維素柱層析,純化了2個敏感蟲株和2個抗藥蟲株裂殖子,通過比較,選定離心管加樣三分之二高度,600rpm離心8分鐘,填充高度為14cm的層析柱分離純化,從30只雞盲腸黏膜中純化裂殖子1.85×10<'7>個,平均每只雞獲得裂殖子6.17×10<'5>個,其中雜質(zhì)極少,其純度適用于mRNA差異顯示等分子生物學(xué)研究,分別分離純化了柔嫩艾美耳球蟲馬杜霉素敏感蟲株和抗藥蟲株5×

4、10<'8>個裂殖子.柔嫩艾美耳球蟲敏感蟲株和抗藥蟲株的mRNA差異顯示.采用錨定引物和隨機(jī)引物,首次對馬杜霉素敏感蟲株和馬杜霉素抗藥蟲株進(jìn)行差異顯示PCR,共回收34條差異片段,反向Northern點(diǎn)雜交鑒定4個片段為陽性,對陽性克隆測序、同源性比較.來自于馬杜霉素抗藥蟲株裂殖子的ACD3-2序列與柔嫩艾美耳球蟲微線-5同源性達(dá)99﹪,說明ACD3-2序列是該基因的部分序列,微線-5蛋白與蟲體融解宿主細(xì)胞膜、入侵、運(yùn)動和溢出有關(guān),在第

5、二代裂殖子時期,抗藥性蟲株該序列發(fā)生轉(zhuǎn)錄,而在敏感蟲株中沉默.HCD1序列來自馬杜霉素敏感蟲株,該片段與柔嫩艾美耳球蟲表面抗原16和17序列同源性分別為83﹪和86﹪,沒有該表面抗原功能的報道.AGD5片段來自抗藥蟲株,HAD8-2序列來自敏感蟲株.通過比較認(rèn)定這兩條序列為新序列,它們所代表的基因的意義尚不清楚.實驗室球蟲抗藥性分子檢測的初步研究.選擇在敏感蟲株中沉默,抗藥蟲株中表達(dá)的特異序列AGD5設(shè)計檢測引物,采用RT-PCR方法,