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1、雞球蟲病是由艾美耳屬的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)等7種球蟲單獨(dú)或混合感染腸道不同部位所引起的一種腸道細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲病。 (1)本研究利用雞胚腸上皮細(xì)胞來(lái)替代雞腎細(xì)胞,建立一種新型的雞球蟲體外細(xì)胞培養(yǎng)模型,因?yàn)榍蛳x感染腸上皮細(xì)胞的條件和過程更加接近了雞體自然感染狀態(tài)。探討了雞胚腸上皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法,結(jié)果顯示,雞胚腸上皮細(xì)胞,在37℃用Ⅰ型膠原酶分步消化70 min,低速離心后接種培養(yǎng)板,90 min
2、后將未貼壁的細(xì)胞移至新的有膠原鋪底的24孔培養(yǎng)板中,5%CO2 39.5℃,DMEM含5%胎牛血清的條件下培養(yǎng),24~48 h細(xì)胞貼壁,7~8 d長(zhǎng)成單層。 (2)收集純化的球蟲子孢子,接種于適合球蟲生長(zhǎng)發(fā)育的雞胚腸上皮原代細(xì)胞,采用這一細(xì)胞模型探索了E.tenella裂殖生殖階段的發(fā)育情況,經(jīng)試驗(yàn)確定了最適球蟲繁殖的培養(yǎng)基和添加成分,建立了艾美耳球蟲雞胚腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株。結(jié)果表明,在細(xì)胞培養(yǎng)第8天時(shí)接種子孢子,子孢子在接種
3、2 h后基本入侵細(xì)胞。換新的培養(yǎng)液重新培養(yǎng),每12 h觀察一次,3~4 d出現(xiàn)第一代裂殖體,5~7 d出現(xiàn)第二代裂殖體,7~8 d出現(xiàn)卵囊。該模型為球蟲有關(guān)生理生化、免疫學(xué)、疫苗制備、藥物效力試驗(yàn)等方面的研究工作,以及球蟲病的防治研究開辟了新途徑。 (3)同時(shí)根據(jù)Etenella HSP70基因(GenBank Locus:Z46965.1)設(shè)計(jì)特異性引物,以RT-PCR方法擴(kuò)增了E. tenella廣東株基因序列,并將其克隆至
4、表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Rosetta菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),實(shí)現(xiàn)其在宿主菌Rosetta中表達(dá)。先前表達(dá)的以pET-32aa(+)為載體的HSP70蛋白多為包涵體形式存在于菌體細(xì)胞內(nèi),通過不斷反復(fù)摸索表達(dá)條件,更換pMAL-e2X為表達(dá)載體,獲得了可溶性的融合蛋白,并結(jié)合Amylose Resin層析獲得較高濃度的目的蛋白。同時(shí)將HSP70基因插入pcDNA-6載體中,構(gòu)建DNA疫苗表達(dá)載體,將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,結(jié)果表明,H
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