應用基因芯片篩選莫尼茨絳蟲種間差異表達基因.pdf

1、目的：為加深對莫尼茨絳蟲表達基因信息的了解，建立了擴展莫尼茨絳蟲基因表達譜芯片，達到研究莫尼茨絳蟲成蟲不同發(fā)育階段基因表達改變的目的，從分子水平上探索與生長發(fā)育有關(guān)的基因。 方法：利用SMART技術(shù)，采用Clontech公司的SMARTTM cDNA Library Construction Kit構(gòu)建擴展莫尼茨絳蟲成蟲全長cDNA文庫。用Trizol Reagent提取總RNA和Oligotex mRNA Kits分離mRNA

2、，以逆轉(zhuǎn)錄酶PowerScriptTM合成第一鏈cDNA，通過LD-PCR合成并擴增ds cDNA；擴增產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、過SPIN-400TM柱去除小片段，連接到SfiⅠ消化過的pBluescriptⅡ SK*質(zhì)粒載體中，最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliDH-5α內(nèi)得到原始文庫，擴增后將文庫保存于96孔細胞培養(yǎng)板中。用文庫得到的1080個EST制備了擴展莫尼茨絳蟲cDNA芯片。該芯片一個域有52行、78列，密度為863

3、點/c㎡，其中包含1080個靶基因，9個陽性對照，16個陰性對照，8個空白對照，每個基因做3個重復。用擴展莫尼茨絳蟲的幼節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)以及貝氏莫尼茨絳蟲的幼節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)與擴展莫尼茨絳蟲頭頸節(jié)總RNA與芯片進行雜交，獲得不同發(fā)育階段的差異表達基因，并選擇其中有差異表達的部分基因進行實時熒光定量RT-PCR驗證。 結(jié)果：構(gòu)建的cDNA文庫滴度為2.52×105 pfu/ml；重組率為94.7％，插入片段多在0.5kb～3 kb之間

4、，測序結(jié)果顯示EST平均長度586 bp。經(jīng)5'端測序獲得2642條有效序列，歸并為1080條Unigene。與GenBank庫中的人、小鼠、線蟲和斑馬魚蛋白庫比對，找到361條保守基因，數(shù)目最多的是兩類編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶的基因。向NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫提交了一個系列的雜交結(jié)果，系列號為GPL1164，共包含6張貝氏莫尼茨絳蟲基因表達譜和6張擴展莫尼茨絳蟲基因表達譜。通過差異基因篩選，共找到擴展莫尼茨絳蟲幼節(jié)特異表達基因1條，成節(jié)特異表達

5、基因50條，孕節(jié)特異表達基因42條；貝氏莫尼茨絳蟲幼節(jié)特異表達基因8條，成節(jié)特異表達基因54條，孕節(jié)特異表達基因31條；兩個蟲種共有的成節(jié)特異表達基因23條，孕節(jié)特異表達基因5條，未找到幼節(jié)共有的特異表達基因；篩選出擴展莫尼茨絳蟲表達但貝氏莫尼茨絳蟲未表達或該基因在兩蟲種間同源性低的基因16條。 結(jié)論：成功構(gòu)建了擴展莫尼茨絳蟲成蟲全長cDNA文庫，獲得了較豐富的擴展莫尼茨絳蟲成蟲表達基因，為篩選擴展莫尼茨絳蟲的功能基因全長序列奠

6、定了基礎(chǔ)。后續(xù)的芯片雜交篩選出特異表達基因，這些基因經(jīng)GO功能分類主要有：胞苷酸激酶、cAMP依賴的蛋白激酶、磷酸丙酮酸水合酶、金屬離子結(jié)合、ATP結(jié)合等，大部分基因功能未知。成節(jié)特異高表達基因主要有鈣調(diào)素、烯醇酶、β-微管蛋白、胞苷酸激酶和腺苷酸激酶、富含半胱氨酸蛋白前體等；孕節(jié)特異高表達基因主要有Ag5前體等；對這些基因的生物學功能結(jié)合當前數(shù)據(jù)庫和文獻報道，成節(jié)鈣調(diào)素高表達而孕節(jié)則下調(diào)，可能說明鈣調(diào)素在成節(jié)生殖功能最旺盛時有利于肌肉