龍須菜世代差異基因在其不同世代及不同發(fā)育階段的轉錄分析.pdf

1、龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）是一種重要的產(chǎn)瓊膠紅藻，其生活史包括一個單倍的配子體世代和兩個二倍的孢子體世代，即四分孢子體及寄生在雌配子體上的果孢子體。龍須菜的四分孢子體和雌、雄配子體在形態(tài)上是相同的，可在同一時間和空間條件下觀察到三種藻體，只有在藻體成熟后通過孢子囊、配子囊或果孢子體等特征才能區(qū)分。到目前為止，關于紅藻性別相關基因在其不同世代及不同發(fā)育階段的調(diào)控等還不清楚，相關報道很少，也不夠深入。本文擬運

2、用實時熒光定量 PCR技術對在之前構建的龍須菜配子體抑制性消減雜交文庫中篩選得到的陽性克隆進行進一步的分析及篩選驗證，為龍須菜性別及世代發(fā)育調(diào)控機制的研究進行初步探討，同時也為紅藻類的性別決定研究提供更多的參考。
　　研究表明，內(nèi)參基因的選擇對實時熒光定量PCR的結果會產(chǎn)生直接的影響。尤其是對于本實驗所針對不同世代及發(fā)育階段的龍須菜來說，常用的一些內(nèi)參基因不一定適合。因此本論文以龍須菜雌配子體的成熟部分及未成熟部分、四分孢子體以及

3、雄配子體為實驗材料，首先進行實時熒光定量 PCR內(nèi)參基因的篩選。根據(jù)geNorm和NormFinder兩種軟件對9個候選內(nèi)參基因ACT、Rubc-L、GAPDH、ITS1、18S、28S、CoI、PEB、NR在四種實驗材料中表達的穩(wěn)定性進行評價，選擇了表達最穩(wěn)定的Rubc-L基因和CoI基因作為內(nèi)參基因，對龍須菜不同性別及不同發(fā)育階段差異表達基因?qū)崟r熒光定量PCR分析。
　　為了得到在龍須菜不同世代及不同發(fā)育階段的差異表達基因，即

4、潛在的相關基因，本實驗室在前期工作中建立了5個龍須菜抑制性消減雜交文庫并進行了斑點雜交分析和測序。本論文通過對這些SSH文庫篩選得到的1873個陽性克隆的序列進行聚類分析，共得到了365條可用序列，其中包括118個重疊群以及247條未被聚類進任何重疊群的單條序列。用Blast2GO在線軟件對聚類得到的序列進行了注釋分析，對消減雜交結果進行了進一步的整理和明確。由于時間關系本論文只選取了其中的8條序列進行定量PCR分析。其中包括全部屬于雌

5、配子體庫中的4條序列，contig-3、contig-52、contig-60和7310，雄配子體庫中的3條序列，contig-35、contig-11和contig-19以及一個各庫混雜的序列contig-44。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，contig-3、contig-60、contig-52和7310的相對表達基本與SSH文庫篩選結果一致，在雌配子體中大量表達，序列7310是與發(fā)育相關的一個基因，在雌配子體中的表達量遠遠大于四分孢子體和雄配子體，

6、而在成熟與未成熟的雌配子體中沒有明顯表達差異，有可能這個序列與雌配子體細胞中早期與發(fā)育為雌性特征的表達相關。
　　981型龍須菜是選育出的耐高溫良種。經(jīng)長期的栽培發(fā)現(xiàn)其營養(yǎng)生長旺盛且不易成熟，因此不易斷折。為了探究981的該種特性與生長發(fā)育調(diào)控的關系，我們從已建立的抑制性消減雜交文庫中篩選了7個四分孢子體差異表達基因進行進一步的篩選分析。分析結果顯示盡管這些基因與有性生殖無關，但與生長相關的基因在981龍須菜中的高表達也證實了該良