ZnT3基因敲除對蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷的保護(hù)作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷病理生理學(xué)機(jī)制尚未清楚,雖然SAH后興奮性遞質(zhì)釋放引起的興奮性中毒學(xué)說已被證實(shí),但伴隨GABA釋放的大量Zn離子對于SAH后早期腦損傷的影響并不清楚。
  目的:
  探究ZnT3敲除對于蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的作用,為蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦保護(hù)提供新思路。
  材料和方法:
  一、材料
  本次研究用ZnT3雜核小鼠(美國,JaxLab實(shí)驗(yàn)室Slc30a3t

2、m1 Rpa),由中國醫(yī)科大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室池志宏教授慷慨提供。小鼠自由攝食水,飼養(yǎng)條件保持12小時(shí)白夜交替,小鼠自由交配。
  二、實(shí)驗(yàn)方法
 ?。ㄒ唬┗蛐丸b定和分組
  采集2月齡鼠尾,通過聚合酶鏈反應(yīng)-凝膠電泳,結(jié)果區(qū)分基因型。保留ZnT3野生型(ZnT-3+/+)和ZnT3基因敲除型(ZnT-3-/-)。實(shí)驗(yàn)用鼠分為WT-Con組(野生對照組)6只,WT-SAH組(野生蛛網(wǎng)膜下腔組)9只,ZnT3 KO-SA

3、H組(基因敲除蛛網(wǎng)膜下腔出血組)9只。
 ?。ǘ┲刖W(wǎng)膜下腔出血模型建立
  WT-SAH組及ZnT3 KO-SAH組均采用頸內(nèi)動脈穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。簡要操作如下:稱取小鼠重量,按照0.6ml/100g,常規(guī)腹腔注射5%水合氯醛注射液麻醉。仰臥位固定于顯微鏡操作臺上,頸部備皮后常規(guī)碘伏消毒3遍。沿正中線切開皮膚,長約7mm。分離兩側(cè)腺體,游離頸外動脈,電凝頸外動脈分支,結(jié)扎遠(yuǎn)心端,近心端用5-0結(jié)扎,中間預(yù)留7-

4、0活結(jié)。在預(yù)留活結(jié)上剪一小口,插入6-0尼龍線。尼龍線經(jīng)頸動脈分叉后避過翼鄂動脈,遇到突破感后繼續(xù)插入2mm,進(jìn)線總長約1cm(圖1A和1B),退出尼龍線,縫合創(chuàng)口。WT-Con組進(jìn)行上述操作但不穿破血管。此種方法可以模擬動脈瘤破裂導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血。所有小鼠術(shù)后恒溫飼養(yǎng),自由攝食。
 ?。ㄈ┲刖W(wǎng)膜下腔出血量評分和神經(jīng)行為學(xué)評分
  術(shù)后24小時(shí)處死前對各組小鼠依據(jù)由Garcia等報(bào)道改良的評分系統(tǒng)盲法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分

5、,同時(shí)準(zhǔn)確記錄各小鼠評分。小鼠處死后進(jìn)一步對蛛網(wǎng)膜下腔出血量進(jìn)行評分。處死小鼠后迅速分離大腦。對小鼠腦底面,主要是Willis環(huán)和基底動脈周圍攝取高分辨率圖片。然后依據(jù)Sugawara的方法劃分評估區(qū)域,并對每一部分出血量進(jìn)行評估。記錄每只小鼠評分。篩選8-12分為實(shí)驗(yàn)取材,消除出血量不同對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響。
 ?。ㄋ模┖qRHE、Nissl染色及皮質(zhì)Tunel染色
  取材后4%多聚甲醛固定,-20℃冰凍切片。對每組按照試劑盒操

6、作進(jìn)行HE、Nissl及Tunel染色。顯微鏡照相后應(yīng)用IPP5.0進(jìn)行圖像分析。,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  在蛛網(wǎng)膜下腔出血量8-12分內(nèi)行為學(xué)變化與出血量呈負(fù)相關(guān);WT-SAH組較WT-Con組小鼠小鼠行為學(xué)有明顯差異,神經(jīng)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重;KO-SAH組較WT-SAH組行為學(xué)改善,神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少。
  結(jié)論:
  ZnT3敲除一定程度上減輕了蛛網(wǎng)膜下腔出血對神經(jīng)細(xì)胞損傷,ZnT3敲除后對蛛網(wǎng)

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