自噬在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　 蛛網(wǎng)膜下腔出血約占全部腦卒中的5％～10％，其中大部分的出血原因為顱內(nèi)動脈瘤破裂。盡管血管介入、手術(shù)技巧、診斷方法以及圍手術(shù)期的處理已經(jīng)取得巨大的進(jìn)步，但蛛網(wǎng)膜下腔出血病人的預(yù)后仍有待進(jìn)一步改善。過去數(shù)十年來，腦血管痙攣和動脈瘤破裂再出血一直被認(rèn)為是導(dǎo)致高死亡和高致殘的一個主要因素。但多中心的臨床試驗研究表明遲發(fā)性血管痙攣的減輕并沒有改善蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的預(yù)后。流行病學(xué)研究提示，大約2/3的死亡發(fā)生在蛛網(wǎng)膜下腔

2、出血后48小時之內(nèi)，而遲發(fā)性血管痙攣多發(fā)生于出血后4天至2周左右。因此有學(xué)者提出了早期腦損傷是蛛網(wǎng)膜下腔出血致死致殘的主要原因。
　　 早期腦損傷這一概念指從蛛網(wǎng)膜下腔出血開始至72小時這一時間窗之內(nèi)的腦損傷。目前蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的病理生理學(xué)機(jī)制已經(jīng)有了初步的認(rèn)識，主要包括顱內(nèi)壓升高、腦血流量降低、腦灌注壓下降、有氧呼吸的抑制、血腦屏障破壞、腦水腫及神經(jīng)元的死亡。然而，具體的損傷機(jī)制及信號通路還需要進(jìn)一步的深入研究。<

3、br>　　 自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的一個降解和再利用系統(tǒng)，對蛋白質(zhì)等大分子和細(xì)胞器進(jìn)行降解，表現(xiàn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量包裹者細(xì)胞漿和細(xì)胞器的空泡結(jié)構(gòu)及溶酶體對空泡內(nèi)成分的降解，降解產(chǎn)物可作為新合成蛋白質(zhì)或能量代謝的原料。自噬已經(jīng)證實在生物體發(fā)育、腫瘤、感染及神經(jīng)退行性疾病等中起關(guān)鍵作用。自噬具有維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，但越來越多的研究證實自噬同樣也可以引起細(xì)胞死亡。因此，自噬在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用成為了目前此

4、研究領(lǐng)域的熱點。
　　 在本研究中，我們分別應(yīng)用自噬的誘導(dǎo)劑及抑制劑來調(diào)控自噬的水平，監(jiān)測不同的自噬激活狀態(tài)下早期腦損傷的程度，并通過檢測凋亡相關(guān)蛋白來探討自噬的作用機(jī)制，以期為蛛網(wǎng)膜下腔出血的治療提供新策略和新靶點。
　　 實驗方法
　　 1.采用線栓穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，成年雄性大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組和蛛網(wǎng)膜下腔出血6h、24h、72h組，通過神經(jīng)功能缺陷評分，腦水腫含量測定檢測腦損傷程度。采用免疫組

5、織化學(xué)和Wegernblot檢測自噬相關(guān)蛋白(Atg5，Beclin1和LC3)的表達(dá)，并用透射電子顯微鏡觀察蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中自噬體的形成。
　　 2.自噬的激活劑雷帕霉素和自噬的抑制劑3-methyladenine(3-MA)分別通過側(cè)腦室給藥注射給藥，成年雄性大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組、蛛網(wǎng)膜下腔出血組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+雷帕霉素組和蛛網(wǎng)膜下腔出血+3-MA組。通過神經(jīng)功能缺陷評分，腦水腫含量測定檢測早期腦損傷程度。采用Wes

6、ternblot檢測自噬相關(guān)蛋白(Atg5，Beclin1和LC3)的表達(dá)。
　　 3.成年雄性大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組、蛛網(wǎng)膜下腔出血組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+雷帕霉素組和蛛網(wǎng)膜下腔出血+3-MA組，采用Wegemblot檢測凋亡相關(guān)蛋白(Bax，Bcl-2，細(xì)胞色素C和Caspase3)的表達(dá)，TUNEL法測定神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度，透射電子顯微鏡觀察大腦皮層組織超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果
　　 1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦皮層中A

7、tg5和Beclin1的表達(dá)和LC-3Ⅱ/LC3-Ⅰ較對照組相比明顯升高(P<0.05)，并且在24h達(dá)到頂峰(P<0.01)。免疫熒光提示Beclin1在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)。透射電子顯微鏡顯示，SAH后6H、24H和72H大鼠大腦皮層神經(jīng)元胞漿中雙層膜結(jié)構(gòu)和自噬小體明顯增多。
　　 2.雷帕霉素預(yù)處理后，蛋白Atg5和Beclin1的表達(dá)明顯升高，LC-3Ⅱ/LC3-Ⅰ增加(P<0.05)；腦水腫及神經(jīng)功能缺陷評分相比

8、蛛網(wǎng)膜下腔出血組明顯改善(P<0.05)。相反，3-MA預(yù)處理下調(diào)了蛋白Atg5和Beclin1的表達(dá)，降低了LC-3Ⅱ/LC3-Ⅰ(P<0.05)，加劇了神經(jīng)功能缺陷。
　　 3.雷帕霉素預(yù)處理顯著減少了Bax從胞漿至線粒體的轉(zhuǎn)移，線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，Caspase3的活化和細(xì)胞凋亡(P<0.05)。相反，3-MA預(yù)處理抑制了這些變化并增加了細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論
　　 1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后急性期自噬通路