MMP-9參與大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷病理過(guò)程的機(jī)制研究.pdf

1、目的: 檢測(cè)蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后早期大鼠海馬神經(jīng)元和基底動(dòng)脈基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP-9）的表達(dá)變化，觀察其對(duì)海馬神經(jīng)元和基底動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，及與臨床行為改變、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞和腦水腫的關(guān)系，探討MMP-9參與SAH后早期腦損傷（early brain injury，

2、EBI）的作用機(jī)制。 方法: 1.構(gòu)建大鼠SAH模型：通過(guò)建立三種常用SAH動(dòng)物模型，比較各模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔血液含量及死亡率和病殘率，選擇適于本課題的SAH模型。 2.MMP-9的檢測(cè)：選取不同時(shí)間點(diǎn)，采用RT-PCR和酶譜分析方法分別檢測(cè)海馬、腦基底動(dòng)脈MMP-9在mRNA水平的表達(dá)及蛋白活化；采用western blot方法檢測(cè)海馬MMP-9總蛋白表達(dá)。 3. laminin及細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用免疫

3、組織化學(xué)、原位末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidal transferase-mediated dUTP-biotin nick endlabeling，TUNEL）檢測(cè)海馬、基底動(dòng)脈laminin的表達(dá)及神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 4.組織病理學(xué)檢測(cè)：通過(guò)檢測(cè)腦內(nèi)伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）檢測(cè)BBB通透性改變，并通過(guò)測(cè)定腦組織含水量（brain water content，BWC）觀察腦水腫

4、程度。 5.形態(tài)學(xué)觀察：通過(guò)HE染色方法觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變，并通過(guò)測(cè)定基底動(dòng)脈管壁厚度及管腔直徑，觀察急性腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）。 6.行為學(xué)觀察：于造模后24 h進(jìn)行臨床行為評(píng)估。 7.干預(yù)治療的作用：應(yīng)用MMP-9特異性抑制劑SB-3CT抑制MMP-9活性，觀察其與細(xì)胞凋亡、BBB改變及腦水腫的變化關(guān)系；應(yīng)用米諾環(huán)素抑制MMP-9活性，觀察其對(duì)EBI的保護(hù)作用

5、。 結(jié)果: 1.視交叉前池注血模型蛛網(wǎng)膜下腔血液含量較其他兩種模型波動(dòng)小，病死率和病殘率與臨床發(fā)生率相近。 2.MMP-9的表達(dá)：與sham組相比，大鼠SAH后12 h海馬和基底動(dòng)脈MMP-9mRNA含量、蛋白表達(dá)及活性明顯升高，24 h達(dá)到高峰，以后逐漸下降，但48 h、72 h仍維持在較高水平（P<0.05或P<0.01）。 3.免疫組化方法顯示：與sham組相比，大鼠SAH后12 h海馬和基底動(dòng)脈l

6、aminin表達(dá)開(kāi)始下降，24 h降至最低，以后逐漸升高，但48h、72 h海馬laminin表達(dá)仍維持于較低水平（P<0.01）。 TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與sham組相比，大鼠SAH后12 h海馬及基底動(dòng)脈TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增加，24 h達(dá)到高峰，并于48 h表達(dá)開(kāi)始下降，72 h TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)仍較高（P<0.01）。 4.組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：SAH后6h組大鼠腦內(nèi)EB含量及BWC與sham組相比差異無(wú)統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)意義；SAH后12 h大鼠腦內(nèi)EB含量及BWC開(kāi)始升高，24 h達(dá)最高，以后逐漸下降，但SAH后48 h、72 h仍維持于較高水平（P<0.01）。 5.HE染色顯示：SAH后12 h組海馬CA1區(qū)變性神經(jīng)元明顯增多，與sham組相比，正常神經(jīng)元密度明顯降低（P<0.05），24 h正常神經(jīng)元密度達(dá)最低，48 h、72 h組正常神經(jīng)元密度仍較低（P<0.01）。同時(shí)，與sham組相比，SAH后12 h大鼠基底動(dòng)脈管腔縮小，管

8、壁增厚，24 h基底動(dòng)脈痙攣?zhàn)顬槊黠@，內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，48h基底動(dòng)脈痙攣較24 h減輕，72 h基底動(dòng)脈管腔直徑和管壁厚度與sham組相比無(wú)明顯異常。 6.行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：各組只有少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，各組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；SB-3CT組大鼠進(jìn)食及活動(dòng)情況明顯優(yōu)于SAH組及sham組（P<0.05）。 7.干預(yù)治療顯示：SAH后24 h，SB-3CT及米諾環(huán)素能夠明顯抑制MMP-9表達(dá)及活

9、性（P<0.01），海馬TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較sham組明顯減少（P<0.01），海馬神經(jīng)元形態(tài)得到改善。 結(jié)論: 1.視交叉前池注血模型更好的模擬臨床SAH，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，適合于SAH后EBI病理生理機(jī)制的研究。 2.大鼠SAH后MMP-9可能通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外凋亡通路，即降解其底物laminin，導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞及基底動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡這一機(jī)制，參與EBI的病理過(guò)程。 3.SB-3CT抑