SIRT3在實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)作為臨床上較為常見(jiàn)的一種腦血管危重癥疾病，約占所有中風(fēng)類(lèi)型的5％。據(jù)報(bào)道，每年全球約有1/10000的人群罹患動(dòng)脈瘤性SAH，其致殘率和致死率高達(dá)50％。隨著醫(yī)療器械和手術(shù)技術(shù)的不斷更新，推動(dòng)SAH的診斷和治療領(lǐng)域取得顯著進(jìn)步，但迄今為止臨床療效仍難以令人滿(mǎn)意，缺乏突破性進(jìn)展。傳統(tǒng)研究認(rèn)為，遲發(fā)性腦血管痙攣(Delayed cerebr

2、alvasospasm，DCVS)應(yīng)為動(dòng)脈瘤性SAH后導(dǎo)致不良預(yù)后最為重要的原因，但抗痙攣治療在臨床上對(duì)改善病人預(yù)后卻收效甚微。
　　近年來(lái)早期腦損傷(Early brain injury，EBI)在動(dòng)脈瘤性SAH后繼發(fā)損傷中的重要作用逐漸得到研究學(xué)者的重視，一般將其定義為SAH后72小時(shí)內(nèi)由多因素造成的腦組織的整體性損傷，目前研究認(rèn)為EBI通過(guò)多途徑影響預(yù)后，涉及包括氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡在內(nèi)的一系列病理生理改變，然而確切完整的機(jī)

3、制尚不十分明確，亟待突破性的研究進(jìn)展，以期為SAH患者提高生存率和改善預(yù)后提供最佳的治療策略。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)作為Sirtuin家族成員之一，進(jìn)化過(guò)程中高度保守并依賴(lài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)，具有去乙?；柑匦裕谀X組織中有豐富的表達(dá)。作為一種調(diào)節(jié)能量平衡的關(guān)鍵性保護(hù)性因子，研究表明SIRT3蛋白通過(guò)調(diào)控線粒體內(nèi)相關(guān)的乙酰化蛋白脫乙?；?/p>

4、水平參與線粒體蛋白的翻譯后修飾調(diào)節(jié)，影響線粒體的能量代謝、底物氧化、炎癥趨化和細(xì)胞凋亡等活動(dòng)，成為機(jī)體多種疾病的病理發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用機(jī)制之一，近兩年來(lái)已成為氧化損傷、炎癥及缺血性損傷研究的熱點(diǎn)之一，在心臟、肝臟、腎臟的疾病研究中取得長(zhǎng)足的進(jìn)步，但在出血性腦卒中研究中還鮮有報(bào)道。結(jié)合既往研究成果提示SAH后早期自由基損傷、炎癥反應(yīng)激活機(jī)制在EBI病程發(fā)生發(fā)展中極為關(guān)鍵的作用，本研究我們合理推測(cè)SIRT3可能參與SAH后EBI形成過(guò)

5、程，通過(guò)調(diào)控線粒體功能參與抗炎及自由基氧化損傷的保護(hù)性機(jī)制，發(fā)揮其起SAH后EBI的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　研究方法：
　　本研究設(shè)計(jì)分三部分實(shí)施，第一部分首先采納頸內(nèi)動(dòng)脈線栓刺破法建立實(shí)驗(yàn)性SAH的大鼠動(dòng)物模型，并予以SIRT3激活劑白藜蘆醇(Resveratrol)干預(yù)治療，通過(guò)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量、血腦屏障通透性以及皮層神經(jīng)元凋亡情況以達(dá)到良好的模型動(dòng)物質(zhì)量控制和評(píng)估SIRT3激活后對(duì)EBI的保護(hù)效果;

6、第二部分進(jìn)一步通過(guò)熒光定量RT-PCR、Western blot及免疫組化觀察實(shí)驗(yàn)性SAH后早期大腦皮層組織中SIRT3的轉(zhuǎn)錄翻譯的表達(dá)情況，同時(shí)采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)分別標(biāo)記目標(biāo)蛋白SIRT3和皮層細(xì)胞種屬，進(jìn)一步明確SIRT3的細(xì)胞特異性定位以及其在SAH后早期的種屬特異性細(xì)胞中變化情況;第三部分通過(guò)篩選最佳誘導(dǎo)濃度的二氯化鈷(COCl2)化學(xué)性損傷PC12細(xì)胞模擬SAH后的神經(jīng)元損傷的體外環(huán)境，利用激動(dòng)劑和抑制劑改變PC12細(xì)胞中S

7、IRT3的表達(dá)水平，通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)該損傷條件下，SIRT3表達(dá)水平對(duì)TLR4、PI3K/AKT以及Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步探討SIRT3對(duì)于SAH后EBI損傷保護(hù)的可能分子機(jī)制。
　　1、在體實(shí)驗(yàn)部分:
　　1)采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓穿刺法構(gòu)建SD大鼠的實(shí)驗(yàn)性SAH動(dòng)物模型;
　　2)將實(shí)驗(yàn)大鼠分為對(duì)照組、假手術(shù)組、SAH組以及Resveratrol藥物干預(yù)四組;
　　3)采用Gar

8、cina神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量、血腦屏障通透性、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)等方法評(píng)估模型動(dòng)物的質(zhì)量控制以及藥物干預(yù)對(duì)EBI的保護(hù)效果。
　　4)采用熒光定量RT-PCR、Western blot及免疫組化觀察實(shí)驗(yàn)性SAH早期大腦皮層中SIRT3的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)情況，采用免疫雙標(biāo)技術(shù)分別標(biāo)記目標(biāo)蛋白SIRT3和皮層細(xì)胞特異性種屬，明確SIRT3的細(xì)胞特異性分布情況。
　　2、離體實(shí)驗(yàn)部分:
　　1) MTT法篩選二氯化

9、鈷(COCl2)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞化學(xué)損傷的最佳濃度模擬SAH后的神經(jīng)元損傷的體外環(huán)境;
　　2)在最佳COCl2誘導(dǎo)損傷條件下，予以激動(dòng)劑和抑制劑改變SIRT3表達(dá)水平，通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)該損傷條件下，SIRT3表達(dá)變化對(duì)TLR4、PI3K/AKT以及Nrt2/ARE信號(hào)通路的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1、采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓刺破法成功建立實(shí)驗(yàn)性SAH的大鼠動(dòng)物模型，質(zhì)量控制滿(mǎn)意;
　　2、予以S

10、IRT3激活劑Resveratrol干預(yù)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SAH建模后早期損傷有明確的保護(hù)作用;
　　3、免疫組化顯示SAH建模后早期大鼠大腦皮層組織SIRT3表達(dá)下降，進(jìn)一步采用RT-PCR及Western blot證實(shí)SIRT3從轉(zhuǎn)錄到翻譯水平的表達(dá)均明顯下降;
　　4、經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)鑒定SIRT3蛋白主要為神經(jīng)元胞漿表達(dá)，在SAH建模后早期神經(jīng)元胞漿中SIRT3蛋白表達(dá)下降，在膠質(zhì)細(xì)胞中無(wú)明顯變化;
　　5、成功

11、篩選COCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞化學(xué)損傷的最佳濃度模擬建立SAH后的神經(jīng)元損傷的體外環(huán)境;
　　6、上調(diào)的SIRT3可能通過(guò)上調(diào)Nrf2/ARE通路中的Nrf2表達(dá)水平發(fā)揮其神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)功能，其作用機(jī)制與TLR4以及PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)系并不密切。
　　研究結(jié)論：
　　1、SIRT3激活對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性SAH后早期腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，能有效減輕腦水腫及血腦屏障破壞程度，改善神經(jīng)功能評(píng)分。
　　2、在實(shí)驗(yàn)性S