Nogo-A蛋白參與形成大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙及其作用機(jī)制研究.pdf

1、大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙(malformations of cortical development，MCD)屬于小兒常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常性疾病，近年來(lái)，由于高清影像學(xué)技術(shù)的不斷更新發(fā)展，MCDs的診斷率逐年升高，現(xiàn)已證實(shí)在小于3歲的兒童藥物難治性癲癇病人中原發(fā)MCD的病人高達(dá)80%，MCD已成為小兒難治性癲癇的重要病因之一。因此，闡明MCD的病理發(fā)生機(jī)制對(duì)臨床治療MCD及預(yù)防難治性癲癇的發(fā)生具有重要意義。在已有癲癇癥狀發(fā)作的MCD病人中

2、，局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD)和結(jié)節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complexes，TSC)是最常見的兩種MCD亞型。雖然臨床表現(xiàn)不盡相同，但兩者在大腦病變區(qū)域具有相同的病理學(xué)特征即：
　　 ①皮質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)和柱狀結(jié)構(gòu)紊亂；
　　 ②病灶區(qū)出現(xiàn)大量與癲癇發(fā)作密切相關(guān)的異常細(xì)胞即“異構(gòu)神經(jīng)元”(misshapencells)，這些異構(gòu)神經(jīng)元包括：異形神經(jīng)元(

3、dysmorphic neurons，DNs)、巨型神經(jīng)元(giantneurons，GNs)、FCDⅡb中的氣球樣細(xì)胞(balloon cells，BCs)以及TSC中的巨細(xì)胞(giantcells，GCs)。
　　 現(xiàn)有研究表明，MCD癲癇發(fā)作是異構(gòu)神經(jīng)元“電點(diǎn)燃”病灶臨近腦區(qū)神經(jīng)元后同步放電的結(jié)果，異構(gòu)神經(jīng)元通常被認(rèn)作是MCD癲癇樣放電的內(nèi)在“促發(fā)器(pacemakers)”，臨床資料也證明伴有異構(gòu)神經(jīng)元的MCD患者出現(xiàn)癲

4、癇發(fā)作的幾率更大。因此，闡明異構(gòu)神經(jīng)元的起源以及病理學(xué)發(fā)生對(duì)了解MCD的病理學(xué)發(fā)展及演變具有重要意義。
　　 病理學(xué)上，異構(gòu)神經(jīng)元具有“異形”和“異位”兩個(gè)主要特征，異形是指異構(gòu)神經(jīng)元與正常神經(jīng)元相比，形狀異常以及軸突發(fā)育和指向的異常；異位是指異構(gòu)神經(jīng)元的分布的異常，如大量的異構(gòu)神經(jīng)元滯留于白質(zhì)區(qū)造成皮質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂及畸形(無(wú)腦回，雙腦回，多腦回等)。異構(gòu)神經(jīng)元的異形和異位均被認(rèn)為是形成MCD病灶區(qū)興奮性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重要原因。目前對(duì)于

5、異構(gòu)神經(jīng)元的異形，異位病理發(fā)生的相關(guān)機(jī)制還沒有明確定論，比較公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為胚胎發(fā)育期或皮質(zhì)發(fā)育晚期(圍產(chǎn)期、出生后)神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)向皮質(zhì)遷移時(shí)發(fā)生遷移、分化、及成熟障礙，是MCD病灶中的異構(gòu)神經(jīng)元形成的重要因素之一，因此具有調(diào)節(jié)軸突發(fā)育以及NPCs遷移生理功能的相關(guān)分子成為研究關(guān)注的重點(diǎn)。其中，Nogo-A蛋白，一種氨基酸的膜蛋白，因?yàn)槠涮厥獾碾p重性質(zhì)(軸突生長(zhǎng)抑制因子以及NPCs遷移調(diào)控因子)受到我們的關(guān)注。
　　

6、Nogo-A是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白家族成員，廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程，在生理?xiàng)l件下，Nogo-A高表達(dá)于哺乳動(dòng)物的胚胎期，出生后表達(dá)逐漸降低且主要表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞，少部分表達(dá)于神經(jīng)元。Chen MS[9]在Nature發(fā)表論著，觀察到Nogo-A在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制軸突生長(zhǎng)的作用。隨后研究發(fā)現(xiàn)Nogo-A主要與細(xì)胞表面受體NgR協(xié)同作用，向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)Nogo-66細(xì)胞生長(zhǎng)抑制信號(hào)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了Nogo-A蛋白在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)

7、病理?yè)p傷中所起的重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)Nogo-A在胚胎期神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的輻射遷移活力具有抑制作用，應(yīng)用Nogo-A基因敲除小鼠與野生鼠比較，基因敲除鼠放射遷移的神經(jīng)前體細(xì)胞的活動(dòng)力增強(qiáng)，到達(dá)較上的皮層(CP/MZ)的NPCs數(shù)量增加；同樣使用抗體阻斷NgR or LINGO-1，神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移活性增強(qiáng)；在體外試驗(yàn)中，體外培養(yǎng)的NPCs在加入一定量重組Nogo-A蛋白后，NPCs放射遷移速率減慢，移動(dòng)距離縮短。此外，研

8、究表明Nogo-A蛋白富集與神經(jīng)髓鞘的郎飛結(jié)區(qū)可能影響髓鞘表面選擇性離子通道的表達(dá)分布。因此，Nogo-A蛋白是一種具備在胚胎期抑制神經(jīng)前體細(xì)胞遷移，在成年個(gè)體抑制再生神經(jīng)元軸突形成，調(diào)節(jié)選擇性離子通道分布的具有多重性質(zhì)的蛋白，而過(guò)去研究對(duì)于其在SVZ區(qū)前體細(xì)胞遷移中的作用以及其可能的MCD致癇機(jī)制研究還未見研究報(bào)道。鑒于上述科學(xué)研究背景，我們提出以下科學(xué)問(wèn)題：Nogo-A及其受體在MCD中的具體表達(dá)模式如何？是否表達(dá)于異構(gòu)神經(jīng)元？異常

9、表達(dá)的Nogo-A參與病理發(fā)生的可能機(jī)制有哪些？
　　 為了闡明Nogo-A蛋白及其信號(hào)通路在MCD中的作用及其可能的機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)以下研究?jī)?nèi)容：
　　 1.利用半定量RT-PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了Nogo-A蛋白及其受體在MCD(TSC與FCDⅡb)臨床標(biāo)本中的表達(dá)分布情況；
　　 2.觀測(cè)了Nogo-A蛋白下游相關(guān)信號(hào)分子(LINGO-1、P75、TROY、RhoA)的表達(dá)活化

10、情況；
　　 3.為了調(diào)查Nogo-A對(duì)SVZ NPCs向MCD病灶區(qū)遷移的調(diào)節(jié)作用，我們建立MCD大鼠模型，利用eGFP示蹤遷移的NPCs，并通過(guò)外源性添加和拮抗Nogo-A蛋白觀察Nogo-A對(duì)SVZNPCs向MCD病灶區(qū)遷移的影響，初步揭示Nogo-A蛋白參與異構(gòu)神經(jīng)元病理發(fā)生的相關(guān)機(jī)制。其主要結(jié)果如下：
　　 一、Nogo-A蛋白及其受體在MCD中的表達(dá)分布
　　 1.本研究中，我們利用臨床MCDs常見亞

11、型(TSC和FCDⅡb)的手術(shù)切除標(biāo)本，從基因以及蛋白表達(dá)水平證明Nogo-A以及受體NgR在TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)和FCDⅡb皮質(zhì)致癇灶中表達(dá)上調(diào)。
　　 2.利用免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)法，我們發(fā)現(xiàn)Nogo-A以及受體NgR在TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)和FCDⅡb的皮質(zhì)致癇灶中的表達(dá)定位具有明顯的細(xì)胞特異性，即：都高表達(dá)于來(lái)源于SVZ區(qū)NPCs的異構(gòu)神經(jīng)元上。這些Nogo-A，NgR陽(yáng)性的異構(gòu)神經(jīng)元，除了FCDⅡb中的一些BCs表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞譜系

12、外，大多與神經(jīng)元特異性標(biāo)志物共表達(dá)，表現(xiàn)為神經(jīng)元譜系。這些結(jié)果說(shuō)明，Nogo-A及其受體可能在這些SVZ NPCs源性的異構(gòu)神經(jīng)元的病理發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　 3.與病灶組織不同，Nogo-A，NgR在鄰近MCDs病灶周圍結(jié)構(gòu)基本正常的組織中的表達(dá)并沒有明顯的升高，提示MCDs癲癇發(fā)作可能不是誘導(dǎo)Nogo-A上調(diào)的關(guān)鍵因素。
　　 二、MCD病灶內(nèi)Nogo-A蛋白下游信號(hào)通路的表達(dá)活化
　　 1.利用West

13、ern blot檢測(cè)了Nogo-A下游信號(hào)分子，LINGO-1、P75、TORY、RhoA在TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)和FCDⅡb致癇灶中的表達(dá)情況，結(jié)果表明下游信號(hào)分子LINGO-1、TORY、RhoA在MCDs病灶區(qū)表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組相比有顯著性差異，而P75表達(dá)無(wú)明顯變化，提示在MCDs病灶區(qū)，Nogo-A下游的NgR/LINGO-1/TORY-RhoA信號(hào)通路被激活。
　　 2.進(jìn)一步的免疫組化觀察實(shí)驗(yàn)顯示，LINGO-1、TORY

14、、RhoA在不同異構(gòu)神經(jīng)元都有強(qiáng)烈表達(dá)，包括DNs、BCs、GCs。
　　 三、Nogo-A蛋白與Nav1.1，Nav1.3通道在MCD病灶區(qū)域內(nèi)細(xì)胞定位的相似性分析
　　 1.與正常皮層相比，MCD組織勻漿中Nav1.1基因及蛋白表達(dá)沒有明顯變化；而Nav1.3mRNA及蛋白水平則表達(dá)明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示Nav1.3而不是Nav1.1可能在FCDⅡb病灶的癲癇樣活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。
　　 2.免疫組化

15、結(jié)果顯示，Nav1.3具有特殊的細(xì)胞定位模式，及Nav1.3的免疫反應(yīng)沉積物主要定位于DNs以及GNs。這種表達(dá)方式與Nogo-A的表達(dá)定位方式相似，相關(guān)性研究表明Nogo-A表達(dá)與Nav1.3表達(dá)呈正相關(guān)，這一結(jié)果提示Nogo-A可能與Nav1.3在FCDⅡb病灶區(qū)域的特征性分布密切相關(guān)。
　　 四、Nogo-A蛋白調(diào)節(jié)SVZ來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞遷移的研究
　　 1.本部分研究擬通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，觀察Nogo-A蛋白在M

16、CD不同時(shí)期的空間時(shí)間分布情況，以及通過(guò)干預(yù)方式初步觀察Nogo-A蛋白對(duì)SVZ NPCs的遷移調(diào)節(jié)作用。首先，我們建立的FCFL模型，在行為學(xué)上，具備了FCD模型動(dòng)物的行為特征。形態(tài)學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)鑒結(jié)果顯示：該模型的腦皮層出現(xiàn)了FCD典型的微腦回畸形結(jié)構(gòu)。組織學(xué)觀察可見原有皮層的正常結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)異常的分層結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元排列紊亂，柱狀極性消失，在微腦回畸形邊緣可見一些神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮，偶見一些形態(tài)異常的巨型神經(jīng)元，這些特征與以往的文獻(xiàn)報(bào)

17、道相符。因此建立的FCFL模型符合我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求，也為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)保障。
　　 2.利用腺病毒轉(zhuǎn)染的eGFP作為示蹤劑，我們成功地對(duì)SVZ區(qū)域的NPCs進(jìn)行了在體(in vivo)示蹤觀察。結(jié)果顯示，eGFP-FCFL模型冰凍損傷灶內(nèi)可見eGFP(+)細(xì)胞形成的細(xì)胞遷移流(SFMS)。而且，eGFP(+)細(xì)胞形成的SFMS持續(xù)存在于P10到P75，及大鼠發(fā)育成熟的各個(gè)階段。利用免疫熒光利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，我們對(duì)eG

18、FP-FCFL模型SFMS中的eGFP(+)細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。結(jié)果顯示，SFMS中eGFP(+)不同程度地表現(xiàn)為PSA-NCAM、DCX以及CRMP4陽(yáng)性。這一結(jié)果提示，局部皮層冰凍損傷可以激活了SVZ NPCs向病灶區(qū)遷移，微腦回畸形SFMS中的eGFP(+)細(xì)胞是由SVZ源性的NPCs遷移而來(lái)，這些細(xì)胞具有一定的遷移活性，部分仍保留干細(xì)胞特性。
　　 3.觀察Nogo-A蛋白在模型組及對(duì)照組不同發(fā)育時(shí)期的皮質(zhì)區(qū)域的表達(dá)情

19、況，結(jié)果顯示Nogo-A蛋白隨著大鼠的發(fā)育在大腦皮質(zhì)中的表達(dá)呈逐漸降低的趨勢(shì)。而在P10、P20、P30三個(gè)時(shí)期，模型組相對(duì)對(duì)照組表達(dá)明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異，這一結(jié)果提示在MCD的病理過(guò)程中，在一定的時(shí)期內(nèi)Nogo-A的表達(dá)發(fā)生異常。進(jìn)一步的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組中正常神經(jīng)元Nogo-A主要表達(dá)與胞膜不同，在模型組微腦回及其微腦旁回的神經(jīng)元細(xì)胞中，Nogo-A可見明顯的神經(jīng)元胞漿以及軸突表達(dá)，Nogo-A的免疫陽(yáng)性表達(dá)明顯高于

20、對(duì)照組皮質(zhì)神經(jīng)元，這些結(jié)果為Nogo-A參與MCD的病理發(fā)生機(jī)制提供了形態(tài)學(xué)上的依據(jù)。
　　 4.通過(guò)在P0期采用重組Nogo-A蛋白及Nogo-A拮抗劑(NEP1-40)的干預(yù)研究，結(jié)果顯示提高大腦局部微環(huán)境中Nogo-A表達(dá)的含量，遷移到皮質(zhì)畸形區(qū)域中的eGFP(+)細(xì)胞減少，SMFS呈線性分布，而拮抗劑組遷移到皮質(zhì)畸形區(qū)域中的eGFP(+)細(xì)胞增加，遷移分布更加彌散。這個(gè)結(jié)果提示Nogo-A蛋白對(duì)SVZ NPCs的遷移有抑

21、制調(diào)節(jié)作用。異常表達(dá)的Nogo-A通過(guò)對(duì)NPCs遷移的異常調(diào)控可能是導(dǎo)致異構(gòu)神經(jīng)元異位分布的重要機(jī)制之一。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明：
　　 第一、Nogo-A蛋白及其受體NgR在MCD病人組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且在異構(gòu)神經(jīng)元上特征性地高表達(dá)；
　　 第二、MCD中Nogo-A下游通路中LINGO-1、TORY、RhoA信號(hào)分子被激活，有益地提示Nogo-A可能選擇性地通過(guò)激活NgR/TORY/LINGO-1

22、-RhoA(而非NgR/P75/LINGO-1)所執(zhí)行的生物學(xué)效應(yīng)參與MCD的病理發(fā)生；
　　 第三、在FCDⅡb皮質(zhì)病灶區(qū)中，選擇性Nav1.3通道表達(dá)與Nogo-A呈正相關(guān)，并具有相似的定位分布，提示Nogo-A可能通過(guò)影響Nav1.3通道定位表達(dá)參與異構(gòu)神經(jīng)元電生理特性的調(diào)節(jié)；
　　 第四、異常表達(dá)的Nogo-A通過(guò)對(duì)NPCs遷移的調(diào)控可能是Nogo-A蛋白參與異構(gòu)神經(jīng)元病理發(fā)生的重要機(jī)制之一。
　　 總之