酸敏感離子通道1a在大腦皮質(zhì)發(fā)育不良病理發(fā)生中的作用研究.pdf

1、大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙(malformation of cortical development, MCD)被看作是兒童藥物難治性癲癇的重為重要的病因之一,其最鮮明的病理特征為大腦皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)的紊亂及異構(gòu)神經(jīng)元的出現(xiàn)。流行病學資料表明,約40％的兒童藥物難治性癲癇是由 MCD所致的,同時約75%的MCD患者會發(fā)生癲癇。
　　MCD是一組病理學表現(xiàn)類似疾病的總稱,主要包括局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(focal cortical dysplasia

2、, FCD)、結(jié)節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)、半側(cè)巨腦癥、多小腦回及Sturge-Weber綜合征等亞型。而其中又以FCD和TSC最為多見。流行病學數(shù)據(jù)資料顯示,FCD已成為我國藥物難治性癲癇外科手術(shù)治療的首要病因。2011年,國際抗癲癇聯(lián)盟(International league against epilepsy, ILAE)公布了最新版FCD分型標準。將其區(qū)分為孤立型FCD病灶和聯(lián)合型

3、FCD病灶。其中,孤立性FCD又可通過組織病理表現(xiàn)分為FCD I型和FCDII型。FCD I型的主要病理表現(xiàn)包括皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)的紊亂及肥大神經(jīng)元(HNs)的出現(xiàn)。FCD II型除包含上述病理結(jié)果外,進一步出現(xiàn)異形神經(jīng)元(DNs)和氣球樣細胞(BCs),這些異常的細胞被統(tǒng)稱為異構(gòu)神經(jīng)元(MCs)。
　　先前已有大量研究關注了異構(gòu)神經(jīng)元的來源及其功能。目前公認的研究理論認為,異構(gòu)神經(jīng)元可能是異常的神經(jīng)遷移、增殖和/或凋亡導致的。電生理研

4、究表明,異形神經(jīng)元具有高興奮性,可能在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用。有趣的是,既往被認為發(fā)揮核心作用的氣球樣細胞,并不能產(chǎn)生動作電位?？傊?目前對于異構(gòu)神經(jīng)元病理發(fā)生及FCD癲癇發(fā)生過程所知有限,具體機制仍有待闡明。
　　酸敏感離子通道是一類可被胞外H+激活的非選擇性陽離子離子通道,屬于上皮鈉通道ENaC/退化因子基因DEG通道家族成員,主要通透Na+、Ca2+。目前為止共發(fā)現(xiàn)6種ASIC蛋白亞型,分別由4種ASIC基因編碼而成。ASI

5、C1a是由ACCN2基因編碼的,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)均有廣泛的表達。先前已有大量文獻證實,ASIC1a參與突觸可塑性,學習記憶及恐懼情緒等生理過程。另一方面,ASIC1a在腦缺血,多發(fā)性硬化及癲癇等病理過程中,同樣發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn),在顳葉癲癇大鼠模型海馬CA1-2區(qū),ASIC1a mRNA水平顯著下調(diào)。更為重要的是,在體和離體研究均證實,ASIC1a可縮短癲癇發(fā)作時間,抑制癲癇發(fā)作進程。然而另一方面的證據(jù)顯示,使用非

6、特異性ASICs阻斷劑Amiloride,可延緩邊緣系統(tǒng)癲癇發(fā)作及癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生。在本課題的預實驗中,我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除的FCD臨床標本中ASIC1a表達下降。那么,ASIC1a在FCD中的具體表達模式如何?下調(diào)表達的ASIC1a是否參與FCD病理發(fā)生和癲癇發(fā)生過程呢?這些問題都值得我們進一步關注。
　　為了闡明ASIC1a在FCD病理發(fā)生中的作用。首先,使用real-timePCR、免疫印跡及免疫組織化學等技術(shù)觀察了ASIC1

7、a在臨床FCD標本中的表達和分布;其次,為了了解ASIC1a參與的MCD癲癇發(fā)生過程,我們建立了一種“雙打擊”MCD大鼠模型,利用皮層腦電圖技術(shù),研究了ASIC1a拮抗劑Amiloride對癲癇潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作次數(shù)的調(diào)節(jié)效應;再次,通過原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元,我們證實了ASIC1a介導的酸誘導皮層神經(jīng)元凋亡過程;最后,由于炎性因子可調(diào)節(jié)ASIC1a的表達和功能,我們檢測了炎性細胞因子IL-2系統(tǒng)在FCD中的表達。通過上述研究,我們

8、得到以下結(jié)果:
　　一、ASIC1a在CTX和FCD中的表達分布
　　1.Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示,正常大腦皮層中存在ASIC1a mRNA和蛋白的表達,主要分布于錐體神經(jīng)元和膠質(zhì)樣細胞上;
　　2.在FCD皮質(zhì)勻漿中,ASIC1a mRNA及蛋白水平較正常對照組明顯減弱,FCD II型組織中ASIC1a的表達顯著低于FCD I型。免疫組化結(jié)果顯示,FCD皮質(zhì)中,ASIC1a的免疫反

9、應性顯著降低,主要表達于反應性星形膠質(zhì)細胞和小部分異構(gòu)神經(jīng)元,包括:HNs、DNs及BCs。免疫熒光雙標結(jié)果表明:①ASIC1a免疫陽性神經(jīng)元和反應性星形膠質(zhì)細胞共表達神經(jīng)元標記物NeuN以及星形膠質(zhì)細胞特異性標志物GFAP;②ASIC1a免疫陽性的MCs共表達NeuN,然而未見其共表達GFAP。
　　3. Western blot結(jié)果顯示, FCD皮質(zhì)組織勻漿中,抑制性中間神經(jīng)元標志物parvalbumin(PV), calbi

10、ndin(CB)和calretinin(CR)蛋白表達水平較正常對照組明顯減低。
　　二、ASIC1a對MCD大鼠癲癇發(fā)作的調(diào)節(jié)效應
　　1.我們使用了孕17天大鼠宮內(nèi)γ-射線照射,成年后給予腹腔注射戊四氮的方法建立的“雙打擊”MCD大鼠模型。免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn),在γ射線照射組、PTZ組及γ-射線+PTZ組,ASIC1a的蛋白表達水平較正常對照組顯著減低。再者,γ射線+PTZ組ASIC1a的表達水平顯著低于γ射線照射組和

11、PTZ組。此外,PTZ組ASIC1a表達水平顯著低于γ射線組。
　　2.PTZ注射前90分鐘,腹腔注射ASIC通道的非特異性阻滯劑Amiloride。腦電圖結(jié)果顯示:①在正常大鼠組中,amiloride并未改變癲癇發(fā)作潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作次數(shù)等行為學指標;②而在MCD大鼠組,使用amiloride可延長癲癇發(fā)作潛伏期,而發(fā)作持續(xù)時間顯著縮短。
　　三、ASIC1a介導的酸誘導的皮層神經(jīng)元凋亡
　　1.原代培養(yǎng)小鼠大腦

12、皮層神經(jīng)元,分別給予不同PH值(PH6.8、PH7.0、PH7.1及PH7.2)的酸性培養(yǎng)基15、30及60分鐘。乳酸脫氫酶檢測結(jié)果顯示,酸性培養(yǎng)基誘導皮層神經(jīng)元LDH的釋放具有明顯的PH依賴及時間依賴性。而使用ASIC拮抗劑Amiloride及PcTX-1,可顯著降低酸誘導的皮層神經(jīng)元損傷。
　　2.使用PH6.8的酸性培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元15分鐘,可顯著增加TUNEL陽性的細胞率。而使用Amiloride和PcTX-1可

13、分別減少40%及30%的酸誘導凋亡比率。
　　3.Western blot結(jié)果顯示,酸性培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元后,細胞活化凋亡蛋白Caspase-3表達增高。而Amiloride和PcTX-1可下調(diào)酸誘導的Caspase-3的表達。
　　四、FCD病灶內(nèi)IL-2系統(tǒng)的表達活化及細胞定位
　　1.在 FCD皮質(zhì)組織勻漿中,IL-2及其受體 IL-2Rs(IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ)的mRNA及蛋白表

14、達水平較正常對照組明顯增高。進一步研究發(fā)現(xiàn),在FCD II型組織中, IL-2及其受體的表達顯著高于FCD I型組織。原位雜交及免疫組化結(jié)果顯示,IL-2及其受體在FCD I型組織中,強表達于HNs及細胞微柱;而在FCD II型組織中,強表達于異構(gòu)神經(jīng)元。免疫熒光雙標結(jié)果顯示:①IL-2及其受體免疫陽性神經(jīng)元和反應性星形膠質(zhì)細胞分別與神經(jīng)元標記物NeuN以及星形膠質(zhì)細胞特異性標志物GFAP共表達;②FCD病灶中的T細胞表達IL-2及其受

15、體,然而小膠質(zhì)細胞并未顯示出IL-2及IL-2Rs免疫反應性;○3 IL-2及其受體陽性的MCs與NeuN共表達,然而未見其于GFAP共表達;○4 IL-2及其受體陽性的MCs與vimentin共表達。
　　2.Western blot結(jié)果顯示,FCD病灶內(nèi)IL-2下游信號通路分子JAK1、JAK3及p-STAT5蛋白水平較正常對照組織顯著升高。再者,酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示,可溶性IL-2受體在FCD病灶內(nèi)表達降低。上述結(jié)果提示

16、,JAK-STAT及可溶性IL-2受體參與MCD的病理發(fā)生過程。
　　綜上所述,本研究結(jié)果表明:第一、臨床FCD標本中ASIC1a表達顯示下調(diào),主要表達于反應性星形膠質(zhì)細胞及異構(gòu)神經(jīng)元;第二、在MCD大鼠模型皮層中ASIC1a表達減低,使用ASIC1a拮抗劑可延長MCD大鼠的癲癇發(fā)作潛伏期,同時縮短發(fā)作持續(xù)時間;第三、使用ASIC1a拮抗劑可顯著降低酸誘導的LDH含量、TUNEL陽性的神經(jīng)元數(shù)量及凋亡蛋白caspase-3的表達,