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1、目的:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種由多種原因引起的退行性關(guān)節(jié)疾病,但具體的發(fā)病機制尚不清楚。本課題組前期實驗證實,酸敏感離子通道1a(acid-sensing ion channel1a,ASIC1a)被胞外酸通過介導(dǎo)胞外 Ca2+內(nèi)流活化,且 ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡在 RA進展過程中發(fā)揮重要的作用。本研究主要目的是在體外探究自噬對 ASIC1a介導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的影響,探討
2、自噬在 RA發(fā)病進程中的作用。
方法:體外分離、提取及培養(yǎng)原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞,給于適宜濃度的濃鹽酸刺激,體外建立早期 RA模型。在此基礎(chǔ)上,采用 ASIC1a特異性阻斷劑狼蛛毒素(psalmotoxin1,PcTX1)及 ASIC1a短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA,shRNA)阻斷或沉默 ASIC1a,實驗分為正常組、pH6.0組、PcTX1組、pH6.0+PcTX1組和正常組、pH6.0組、ASIC1a
3、 shRNA組、pH6.0+ASIC1a shRNA組,分別觀察ASIC1a對自噬和凋亡的影響。采用自噬特異性阻斷劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)及 Beclin1小干擾 RNA(small interfering RNA,siRNA)阻斷或沉默自噬,實驗分為正常組、pH6.0組、,3-MA組、pH6.0+3-MA組和正常組、pH6.0組、Beclin1 siRNA組、pH6.0+Beclin1 siRNA組
4、,觀察自噬對ASIC1a介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的影響。透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察細胞內(nèi)自噬小體;單丹黃酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色觀察自噬囊泡的形成; GFP-mRFP-LC3觀察自噬成熟過程;Western blot技術(shù)分析自噬相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達情況;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。
結(jié)果:胞外酸化可明顯上調(diào)
5、自噬蛋白 LC3-II水平,顯著增加胞質(zhì)內(nèi)自噬小體數(shù)量;胞外酸化(pH6.0)3h自噬蛋白 LC3-II、Beclin1,凋亡相關(guān)蛋白剪切性PARP、剪切性 Caspase-3及剪切性 Caspase-9均高表達,該過程可被 PcTX1及ASIC1a shRNA逆轉(zhuǎn);3-MA降低 ASIC1a介導(dǎo)的細胞自噬,并增加 ASIC1a介導(dǎo)的細胞凋亡,表現(xiàn)為 LC3-II、Beclin1蛋白的下調(diào),剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切
6、性 Caspase-9蛋白的上調(diào)以及細胞凋亡率的增加;此外,預(yù)處理的 Beclin1 siRNA降低了自噬蛋白LC3-II、Beclin1的表達,增加了凋亡蛋白剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9的表達以及上調(diào)了細胞凋亡率。
結(jié)論:結(jié)果顯示激活的 ASIC1a可在體外介導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡和自噬的發(fā)生,阻斷或沉默自噬可以增強 ASIC1a介導(dǎo)的細胞凋亡,因此在 RA發(fā)病過程中自噬可能被作為一種新
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