血管內皮生長因子-C在大腦皮質發(fā)育障礙中的作用及機制研究.pdf

1、大腦皮質發(fā)育障礙(MCD)是藥物難治性癲癇的重要病因之一。隨著高清影像學技術的普及,MCD的臨床檢出率不斷提高,現已證實約有40％的藥物難治性癲癇是由MCD所致,而在小于3歲的兒童藥物難治性癲癇病人中更高達80％,因此MCD已成為藥物難治性癲癇研究領域內重點和熱點的問題。MCD是一類病理學表現類似疾病的總稱,主要包括結節(jié)性硬化(TSC)、局灶性皮質發(fā)育不良(FCD)、多小腦回、無腦回畸形及Sturge-Weber綜合征等亞型,其中TSC

2、和FCD是最常見的MCD亞型。盡管MCD根據不同的臨床表現具有不同的分類,但都具有共同的組織病理學特點,表現為大腦皮層層狀結構和柱狀結構紊亂、腦回結構破壞,出現大量異形神經元(DNs)、巨形神經元(GNs)、氣球樣細胞(BCs)以及巨細胞(GCs)等,這些異常的細胞被稱作異構神經元(MNs)。臨床資料表明伴有異構神經元的MCD患者更易出現癲癇發(fā)作,早期出現耐藥。因此,異構神經元在MCD的致癇性中發(fā)揮“核心作用”。目前,對異構神經元的病理

3、發(fā)生機制尚無明確定論,較為公認的觀點認為,異構神經元的產生可能是由胚胎發(fā)育期間神經元遷移,成熟和/或細胞死亡過程中出現異常所致。此外,圍產期和出生后早期的腦損傷可能也參與了異構神經元的病理發(fā)生。總之,目前對MCD及異構神經元病理發(fā)生機制所知有限,對涉及其中的關鍵因子、信號途徑仍待闡明。
　　 VEGF-C是公認的淋巴系統(tǒng)發(fā)生調節(jié)因子,通過激活兩個特異性受體VEGFR-2,VEGFR-3發(fā)揮生物學效應,其中VEGFR-3為VEGF

4、-C的主力型受體。在正常情況下,VEGF-C及VEGFR-3局限性表達于淋巴內皮,而它的另一受體VEGFR-2則在血管內皮和淋巴內皮上均有表達,發(fā)揮其促脈管系統(tǒng)發(fā)生的作用。
　　 由于腦內淋巴系統(tǒng)缺如,既往很少有研究關注VEGF-C在中樞神經系統(tǒng)的作用。直到2006年,有學者發(fā)現當小鼠敲除VEGF-C后,表達VEGFR-3受體的神經的體細胞增殖明顯受阻,而且胚胎視神經中少突膠質細胞前體細胞選擇性缺失,證明VEGF-C信號通路參與

5、了中樞神經系統(tǒng)的生長發(fā)育、發(fā)揮神經營養(yǎng)功能。近兩年來陸續(xù)有研究揭示了VEGF-C信號系統(tǒng)在神經系統(tǒng)中的新作用,如VEGF-C/VEGFR-3能夠介導膠質前體細胞的增殖,遷移。新近報道腦缺血后,定位于海馬齒狀回顆粒細胞層最內側帶的細胞高度表達vEGFR-3,這些細胞同時表達與細胞遷移相關的神經前體細胞標記物PSA-NCAM,表明VEGF-C系統(tǒng)參與腦缺血后海馬神經發(fā)生。此外,腦卒中后,患側SVZ區(qū)內VEGFR-3的表達水平顯著上調,表型鑒

6、定實驗證實絕大多數表達VEGFR-3的細胞主要為具有旺盛增殖活力的神經祖細胞,另有小部分VEGFR-3陽性細胞為具備遷徙能力的神經前體細胞。在本研究預實驗中,我們發(fā)現手術切除的MCD標本中VEGF-CmRNA表達上調。那么,VEGF-C及其受體在MCD中的具體表達模式如何?是否表達于異構神經元?高表達的VEGF-C是否參與MCD所致癲癇發(fā)作?這些問題值得我們關注。
　　 為了闡明VEGF-C在MCD中的作用及其可能的機制,首先,

7、我們利用半定量RT-PCR、western blot、免疫組織化學技術觀察了VEGF-C及其受體在MCD(TSC與FCD亞型)臨床標本中的表達分布情況;其次,觀測了VEGF-C受體信號通路下游相關信號分子的表達活化情況;第三,觀察了與VEGF-C高度同源的VEGF-D在MCD中的表達情況;最后,為了直觀的了解VEGF-C對MCD致癇效應的影響,我們建立MCD大鼠模型,利用膜片鉗全細胞記錄技術,觀察VEGF-C對MCD大鼠異構神經元興奮性

8、谷氨酸受體(NMDA受體)的調節(jié)效應。通過這些研究,我們得到以下結果:
　　 一、VEGF-C及其受體在MCD中的表達分布
　　 1.通過RT-PCR,western blot分析,從基因和蛋白水平證明正常皮層中不同程度地表達VEGF-C、VEGFR-2及VEGFR-3;免疫組化結果表明VEGF-C及其受體主要分布于皮層錐體神經元:
　　 2.在TSC皮層結節(jié)組織勻漿中,VEGF-C及其受體VEGFR-2、VEG

9、FR-3的mRNA及蛋白表達水平較正常對照組明顯升高。免疫組化結果顯示,VEGF-C,VEGFR-2及VEGFR-3特征性的高表達于DNs、GCs及反應型膠質細胞;免疫熒光雙標結果表明:①絕大多數VEGF-C免疫陽性的DNs,GCs共表達神經絲蛋白標記物NF-200;然而未見共表達與另一種神經元標記物NeuN以及星形膠質細胞特異性標志物GFAP共表達;TSC組織中可見CD68陽性的巨噬細胞浸潤,但是這些細胞不表達VEGF-C;②VEGF

10、R-2與VEGFR-3的細胞定位表達模式類似,多數VEGFR-2或VEGFR-3免疫陽性的DNs與NF-200共表達,而共表達VEGFR-2(VEGFR-3)與NF-200的GCs略少,未見VEGFR-2(VEGFR-3)免疫陽性的DNs,GCs共表達GFAP。
　　 3.在另一常見的MCD亞型-FCD中,VEGF-C及受體VEGFR-2、VEGFR-3的mRNA及蛋白表達水平較正常對照組同樣顯著升高。VEGF-C及其受體高表達

11、于DNs,GNs,BCs及膠質細胞。免疫雙標結果顯示:①VEGF-c免疫陽性的異構神經元不表達GFAP;與TSC中表達模式不同的是,FCD中的DNs,GNs,BCs能夠同時表達VEGF-C與NeuN,提示其具有成熟神經元屬性。②VEGFR-3免疫陽性的異構神經元既不表達NF-200,又不表達GFAP,表明其特殊的分子表型。
　　 二、MCD病灶內VEGF-C下游相關信號通路的表達活化
　　 1.RT-PCR結果表明,MC

12、D中Akt的基因表達上調;利用western blot觀察Akt蛋白亞型表達,發(fā)現三種Akt亞型的表達均上調,其中Akt-1的表達上調最為明顯,表明Akt信號通路參與了MCD的病理生理機制。
　　 2.正常皮層及MCD中均可見Bad的表達,且表達水平基本相同;然而,MCD病灶內的磷酸化Bad(p-Bad)表達顯著升高,提示MCD中抗凋亡通路活化。
　　 3.ERK表達于MCD病灶組織和正常皮層中,呈現特征性的44kDa和

13、42 kDa雙條帶(ERK1/2),并可見ERK1/2在MCD中的表達明顯上調。
　　 三、VEGF-D在MCD中的表達分布
　　 1.正常皮層組織勻漿中,可探及VEGF-D mRNA及蛋白表達;免疫組織化學結果表明VEGF-D主要表達于錐體神經元,且免疫反應程度較輕。
　　 2.MCD組織勻漿中,VEGF-D mRNA及蛋白表達水平上調。免疫組織化學實驗發(fā)現:①TSC亞型中VEGF-D表達于多數DNs、GCs及

14、反應性膠質細胞,但免疫陽性強度不一;免疫雙標未發(fā)現VEGF-D陽性異構神經元與NeuN,NF-200,GFAP及CD68共表達;②FCD亞型中可見VEGF-D表達于DNs,GNs,BCs及反應性膠質細胞,免疫雙標結果表明VEGF-D免疫陽性的異構神經元不表達成神經纖維蛋白NF-200,亦不表達成熟星型膠質細胞標記物GFAP。
　　 四、VEGF-C對MCD大鼠異構神經元NMDA受體功能的調節(jié)效應
　　 1.建立MCD動物

15、模型,制備活體腦片后進行膜片鉗全細胞記錄,結果表明①MCD大鼠異構神經元可產生動作電位,但動作電位形態(tài)各異,峰率適應性降低或消失,提示其電生理功能發(fā)育不完善;②異構神經元中可記錄到evoked-EPSC,但電流形態(tài)明顯發(fā)生改變,通道電流成分混雜,電流面積明顯增加,提示MCD異構神經元突觸傳遞效能改變;③MCD異構神經元中NMDA/AMPA受體介導電流的比率顯著上調,這種比率改變主要是由NMDA受體電流成分增多引起,表明異構神經元中NMD

16、A受體功能上調。
　　 2.MCD大鼠異構神經元中VEGF-C及其受體VEGFR-2的表達明顯上調,VEGFR-3的表達辦有增加。
　　 3.100gmol/L NMDA作用于異構神經元后,可誘發(fā)典型的快反應電流,經過100ng/mL VEGF-C孵育后,相同濃度NMDA誘發(fā)的電流顯著增大,提示VEGF-C對NMDA受體產生協同作用;當給予VEGFR-2受體阻斷劑Ki8751預處理后,這種協同效應被阻斷,表明VEGF-C

17、對NMDA受體的調節(jié)效應主要是由VEGFR-2受體介導的。
　　 綜上所述,本研究結果表明:第一、人MCD組織中VEGF-C及其受體VEGFR-2,VEGFR-3表達顯著上調,且特征性地高表達于異構神經元;第二、MCD中VEGF-C下游通路中抗凋亡相關信號分子激活,有益地提示VEGF-C可能通過抗凋亡相關信號通路調節(jié)MCD內異構神經元的生物學行為;第三、VEGF-D在MCD中的表達上調;第四、VEGF-C通過VEGFR-2增強M