鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷的機(jī)制.pdf

1、鎘是具有很強(qiáng)毒性的重金屬，常見于工業(yè)場(chǎng)所、食品污染物和煙草中。低濃度鎘就具有毒性，因?yàn)槠湓隗w內(nèi)的半衰期長(zhǎng)達(dá)10～30年，易在體內(nèi)蓄積，可對(duì)包括肺臟、肝臟、腎臟、睪丸、腦和胎盤在內(nèi)的多個(gè)器官產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。鎘可進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)和神經(jīng)元導(dǎo)致人和動(dòng)物模型的神經(jīng)學(xué)上的改變，引起注意力低下、痛覺敏感性高、嗅覺異常和記憶力下降。一些以神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為模型的體外研究表明，μM級(jí)的鎘就具有神經(jīng)毒性，且這種細(xì)胞毒性與誘導(dǎo)凋亡有一定的相關(guān)性，并得出鎘致皮質(zhì)神

2、經(jīng)細(xì)胞凋亡是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常及導(dǎo)致記憶減退、智力發(fā)育低下的主要原因，但鎘致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未闡明。本研究用孕18～19 d Sprague Dawley(SD)大鼠的胎鼠建立體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞模型，通過體外試驗(yàn)探討了鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷效應(yīng)及其凋亡可能的作用機(jī)理，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)鎘的神經(jīng)毒性作用提供理論依據(jù)。
　　 1、鎘誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑
　　 為從線粒體途徑研究鎘致

3、大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。本研究在建立體外原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒12h，Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平和線粒體膜電位(ΔΨm);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以10μmol/L醋酸鎘染毒大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞0、12、24和48 h，免疫印跡檢測(cè)Caspase-9活化

4、和PARP裂解情況。結(jié)果表明:經(jīng)免疫組化染色鑒定，所培養(yǎng)的原代細(xì)胞為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)陽性，呈現(xiàn)典型神經(jīng)細(xì)胞特征。與對(duì)照組相比，各染毒組細(xì)胞表現(xiàn)核皺縮、染色質(zhì)致密濃染、核碎裂等典型的凋亡特征，ROS水平顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），ΔΨm顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P＜0.01)，同時(shí)經(jīng)10μmol/L鎘處理皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞12h后開始檢測(cè)到C

5、aspase-9活化及PARP裂解大片段。說明鎘誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能通過線粒體途徑。
　　 2、鈣穩(wěn)態(tài)失衡在鎘致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用
　　 為研究鈣穩(wěn)態(tài)失衡在鎘致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用，并探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放在鎘致神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡機(jī)制中的作用。本研究用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘和細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM[1,2-二（2-氨基苯氧基）乙烷-N，N，N’，N’

6、-四乙酸-四乙酰氧甲基酯，1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N'，N’-tetraacetic acid-tetraacetoxymethyl ester(10μmol/L)]以及三磷酸肌醇受體(IP3R)特異性阻斷劑2-APB[2-氨基乙氧基二苯基硼酸鹽，2-aminoethoxydiphenyl borate(50μmol/L)]單獨(dú)或聯(lián)合作用于大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞12h。Hoechst 33258

7、熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i，ATPase酶試劑盒測(cè)定Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性的變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定鈣調(diào)蛋白(CaM) mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，染毒后的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色呈現(xiàn)典型的凋亡特征，各鎘染毒組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i極顯著升高(P＜0.01)，Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯

8、著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，20μmol/L組CaM mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低(P＜0.01)。與相應(yīng)鎘染毒組相比，BAPTA-AM聯(lián)合組凋亡細(xì)胞減少，BAPTA-AM聯(lián)合組和2-APB聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。說明鎘可能通過影響CaM mRNA轉(zhuǎn)錄水平與維持鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)酶(Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase)的活性以及胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫的釋放

9、，從而干擾神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，而細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡在鎘誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起著重要作用。
　　 3、鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響
　　 為探討不同濃度、不同時(shí)間染鎘對(duì)體外培養(yǎng)的原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK磷酸化的影響，大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒3h及10μmol/

10、L醋酸鎘染毒不同時(shí)間(0、1、2、3、4、5、6h)，免疫印跡法測(cè)定樣品ERK1/2、JNK和p38 MAPK總蛋白的表達(dá)及磷酸化水平。結(jié)果表明，5、10、20μmol/L鎘處理細(xì)胞3h后，除5μmol/L鎘處理組ERK1/2磷酸化水平未升高外，其余所有濃度鎘處理組的ERK1/2、JNK1和p38MAPK磷酸化水平均升高，而染鎘后ERK1/2、JNK和p38 MAPK總量無明顯變化;10μmol/L醋酸鎘染毒后，ERK1/2磷酸化水平于

11、2h便開始升高，一直維持到6h; JNK和p38 MAPK磷酸化水平于試驗(yàn)后1h開始升高，3h達(dá)到高峰，之后逐漸下降，但6h內(nèi)仍高于對(duì)照組，ERK1/2、JNK和p38 MAPK總量無明顯變化。說明鎘可引起MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的活化。
　　 4、鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體氧化損傷的影響
　　 為研究鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體的氧化損傷，用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞

12、6h，透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，比色法測(cè)定MDA含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR從轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ表達(dá)的變化。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，各染毒組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化明顯，表現(xiàn)線粒體腫脹，嵴斷裂、部分或完全消失，MDA含量均極顯著升高(P＜0.01)，COXⅠ、COXⅡ基因表達(dá)量均顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，10和20μmol/L染毒組COXⅢ基因表達(dá)量極顯著降低(P＜0

13、.01)。說明鎘可引起線粒體損傷，COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ基因表達(dá)量顯著下降可能與鎘暴露導(dǎo)致的線粒體脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)。
　　 5、鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響
　　 為研究鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞12h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平，并計(jì)算Bcl-

14、2/Bax的比值，免疫印跡檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，各染毒組細(xì)胞Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平均極顯著升高(P＜0.01)，而Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值均極顯著降低(P＜0.01)。此外，免疫印跡的結(jié)果也顯示，隨鎘濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bax蛋白表達(dá)水平升高。提示鎘能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)

15、細(xì)胞凋亡。
　　 6、鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞一氧化氮合酶基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響
　　 為研究鎘對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞一氧化氮合酶基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，用不同濃度(0、5、10、20μmol/L)醋酸鎘染毒大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞12h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，5、10μmol/L組nNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著和極顯著