脂多糖預(yù)激對體外培養(yǎng)小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究目的與意義:
　　機(jī)體或單核-巨噬細(xì)胞先以小劑量脂多糖(Lipopolysaccride, LPS)預(yù)處理后,表現(xiàn)出對LPS的再次刺激呈低反應(yīng)或無反應(yīng)的現(xiàn)象:包括由LPS導(dǎo)致的一系列諸如發(fā)熱、休克乃至死亡等病理生理現(xiàn)象減輕甚至消失,細(xì)胞因子、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等發(fā)生改變,此為內(nèi)毒素耐受。內(nèi)毒素耐受體內(nèi)模型主要在實(shí)驗(yàn)動物中進(jìn)行,在體外模型方面,主要是培養(yǎng)對LPS敏感的細(xì)胞,通過不同劑量LPS處理而得到。大量研究表明,單核巨噬細(xì)胞系

2、是內(nèi)毒素作用的主要靶細(xì)胞,亦是產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受的主要效應(yīng)細(xì)胞。產(chǎn)生耐受時(shí),其主要特征表現(xiàn)為TNF-α等細(xì)胞因子低表達(dá)或無表達(dá)。總體而言,LPS耐受現(xiàn)象主要在傳統(tǒng)免疫活性細(xì)胞中誘導(dǎo)。有證據(jù)表明,在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中,體內(nèi)先采用小劑量LPS預(yù)處理,誘導(dǎo)的LPS耐受可減低腦內(nèi)免疫相關(guān)的炎癥反應(yīng),由此發(fā)揮一定程度的保護(hù)作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)是介導(dǎo)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞群,參與許多腦部疾病的發(fā)生發(fā)

3、展,并表現(xiàn)出多種炎性介質(zhì)以及信號分子的表達(dá)改變。那么,在體內(nèi)誘導(dǎo)的LPS耐受現(xiàn)象是否也能在體外培養(yǎng)的大腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)?其產(chǎn)生耐受的表現(xiàn)是否與其他細(xì)胞以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的表現(xiàn)相似?解答這些問題有利于進(jìn)一步闡明LPS耐受在腦部疾病中的細(xì)胞及分子調(diào)節(jié)機(jī)理。另一方面,在探討神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在LPS耐受現(xiàn)象的同時(shí),可進(jìn)一步了解神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的變化規(guī)律,如分泌某些炎性因子(HMGB-1)的改變,以及某些重要的信號分子如PI3K/Akt通路在耐

4、受誘導(dǎo)中的作用和重新調(diào)配機(jī)制。如果LPS預(yù)處理大腦皮質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞后,可誘導(dǎo)LPS耐受,這些細(xì)胞發(fā)生的功能改變?nèi)绾斡绊懪c之密切溝通的神經(jīng)元的活性與功能?相關(guān)研究表明LPS耐受在減輕疾病炎癥反應(yīng)中有積極的作用,而這些問題的探討將為LPS耐受在神經(jīng)系統(tǒng)疾患中的實(shí)際應(yīng)用提供更豐實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為預(yù)防與治療這些神經(jīng)疾病提供更多有潛在實(shí)用價(jià)值的思路。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.體外培養(yǎng)混合大腦皮質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)分離純化鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)

5、細(xì)胞,采用小劑量(0.01ug/ml)預(yù)處理膠質(zhì)細(xì)胞18小時(shí)后用較大劑量1ug/ml LPS再刺激24小時(shí)。分別經(jīng)過CCK-8試劑盒、ELISA、免疫熒光、uwestern blotting及RT-PCR檢測神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用、分泌細(xì)胞因子功能、NF-κB活性、TLR-4表達(dá)情況,探討這些細(xì)胞是否會發(fā)生猶如單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生LPS耐受時(shí)的變化。
　　2.通過ELISA、免疫熒光以及western blotting檢測LPS預(yù)處理后

6、一些重要炎性介質(zhì)如HMGB-1的轉(zhuǎn)位與蛋白表達(dá)情況,以及某些信號通路分子如SOCS-3表達(dá)、PI3K/Akt通路的活化情況;同時(shí)檢測了采用PI3K/Akt抑制劑處理后LPS預(yù)激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HMGB-1的變化情況,由此進(jìn)一步了解神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過預(yù)激后功能的變化規(guī)律。
　　3.收集預(yù)處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)上清,將其與神經(jīng)元進(jìn)行共孵育,觀察神經(jīng)元的存活情況以及分泌功能,探討LPS預(yù)處理神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的功能變化對神經(jīng)元活

7、性與分泌功能產(chǎn)生的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.在體外采用小劑量LPS預(yù)激星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,可減低這些細(xì)胞細(xì)胞毒作用,而且能明顯下調(diào)分泌其TNF-α水平,這種效應(yīng)可以持續(xù)到再刺激后48小時(shí);同時(shí),TLR-4mRNA表達(dá)水平也呈下調(diào)趨勢;而且,星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB激活程度下降,但小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB激活程度未見明顯抑制。另外,星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)預(yù)激后分泌NO、IL-6的水平增加,出現(xiàn)了活化反應(yīng)表現(xiàn)。

8、>　　2. LPS預(yù)激星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞后其HMGB-1蛋白表達(dá)及胞漿中轉(zhuǎn)位增加;SOCS-3的表達(dá)也增加,另外,PI3K/Akt通路活化增強(qiáng);采用LY294002先將PI3K/Akt通路抑制后,LPS預(yù)激星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB-1蛋白表達(dá)及胞漿轉(zhuǎn)位減少;SOCS-3的蛋白表達(dá)也降低;細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子TNF-α,IL-6水平均降低。
　　3.在星形膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)刺激組條件培養(yǎng)上清的作用下,神經(jīng)元存活率降低;在小膠

9、質(zhì)細(xì)胞各組條件培養(yǎng)上清作用下,神經(jīng)元存活情況變化不大;神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清共孵育后,LPS預(yù)激組上清均能上調(diào)神經(jīng)元分泌TNF-α和IL-6的水平;采用PI3K/Akt抑制劑處理,預(yù)刺激后膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)上清對神經(jīng)元存活情況影響不顯著,對神經(jīng)元分泌TNF-α和IL-6有一定影響,但星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞上清的影響作用表現(xiàn)不一。
　　結(jié)論:
　　1.星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞本身可以成為LPS耐受效應(yīng)的靶細(xì)胞之

10、一,但LPS預(yù)處理后,誘導(dǎo)靶細(xì)胞反應(yīng)性降低的效應(yīng),并非是全面的抑制,不同分子有可能表現(xiàn)為耐受或是活化效應(yīng)。
　　2. LPS預(yù)刺激對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中炎性因子的釋放以及信號分子進(jìn)行了重新調(diào)配,炎癥因子HMGB-1表達(dá)和轉(zhuǎn)位與PI3K/Akt通路活化情況表現(xiàn)一致。PI3K/Akt通路對LPS耐受誘導(dǎo)的效應(yīng)未表現(xiàn)明顯負(fù)向調(diào)節(jié)作用。
　　3.體外LPS預(yù)激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,其培養(yǎng)上清對神經(jīng)元存活未見明顯促進(jìn)作用。由于LPS預(yù)激可重新調(diào)配靶