小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)物對(duì)原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元調(diào)亡的影響.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(Diffuse axonal injury，DAI)是一種原發(fā)性彌漫性腦損傷，是最重要的腦創(chuàng)傷類(lèi)型之一，是引起死亡、嚴(yán)重致殘及植物生存的主要原因。β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，β-APP)的免疫組織化學(xué)染色是診斷DAI的金標(biāo)準(zhǔn)。正常情況下微量的β-APP沿著軸索通過(guò)快速順行軸漿運(yùn)輸至突觸。β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)是β-APP通過(guò)蛋白水解作用后產(chǎn)生的一段淀

2、粉樣肽。當(dāng)軸索發(fā)生損傷后，軸漿運(yùn)輸中斷，從而導(dǎo)致β-APP的積聚并在軸突和胞體中大量表達(dá)，大量的Aβ由于β-APP酶解作用的上調(diào)而聚集在神經(jīng)元的核周體，聚集的Aβ具有毒性作用，并可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　大量研究己證實(shí)，DAI后的神經(jīng)損害不僅發(fā)生在損傷瞬間，且在其后的數(shù)分鐘到數(shù)天內(nèi)還可出現(xiàn)神經(jīng)元延遲性死亡。目前關(guān)于理解DAI發(fā)病過(guò)程相關(guān)的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)已經(jīng)有了明顯的進(jìn)展，然而其形成機(jī)制尚不完全明確，是法醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)亟待解決的難題。

3、在DAI的發(fā)病過(guò)程中，不僅表現(xiàn)為外力直接作用引起的神經(jīng)元受損和死亡，同時(shí)也存在神經(jīng)元凋亡，細(xì)胞凋亡不僅參與了DAI，而且可能在DAI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。Caspase-3屬半胱天冬蛋白酶家族的一員，又被稱作死亡蛋白酶，caspase-3的活化是損傷誘導(dǎo)凋亡的最后共同通路。實(shí)驗(yàn)研究中，多以caspase-3作為研究指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的凋亡。
　　前期研究表明，在體狀態(tài)下DAI大鼠腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元軸突中有β-APP的積聚，

4、在損傷的軸索周?chē)^察到小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集和活化，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的炎癥因子，引發(fā)神經(jīng)元的“二次損傷”，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。然而，離體狀態(tài)下，Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的TNFα和IL-1β是否可以引發(fā)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而參與神經(jīng)元的“二次損傷”及其具體機(jī)制，尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)采用Aβ1-40作用于原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用ELISA和Real Time PCR的方法，通過(guò)檢測(cè)TNFα和IL-1β含量及其mR

5、NA的表達(dá)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況；用激活的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，應(yīng)用Real Time PCR和Hoechst33258染色的方法分別檢測(cè)神經(jīng)元caspase-3 mRNA的表達(dá)和神經(jīng)元的凋亡率，以探討DAI后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化引起神經(jīng)元損傷的可能機(jī)制，為進(jìn)一步闡明DAI病理生理學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為法醫(yī)學(xué)實(shí)際檢案工作中對(duì)DAI損傷的客觀評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1原代培養(yǎng)新生24h內(nèi)SD乳鼠大腦皮質(zhì)小

6、膠質(zhì)細(xì)胞，用Aβ1-40處理小膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、Aβ處理組、Aβ+MC組和MC組。對(duì)照組不加處理因素，Aβ處理組加入1μMAβ1-40作用于小膠質(zhì)細(xì)胞6h，Aβ+MC組在加入Aβ1-40前30min加入0.2μM米諾環(huán)素(Minocycline，MC)，MC組只加入0.2μM MC。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNFα和IL-1β的含量，Real Time PCR檢測(cè)細(xì)胞中TNFα和IL-1β mRNA的表達(dá)。
　

7、　2原代培養(yǎng)新生24h內(nèi)SD乳鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、1/2 Aβ-MCM組、1/4 Aβ-MCM組、1/8 Aβ-MCM組。對(duì)照組神經(jīng)元正常培養(yǎng)，1/2 Aβ-MCM組、1/4 Aβ-MCM組、1/8 Aβ-MCM組分別在神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入1/2、1/4、1/8 Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Aβactivated microglia conditioned media，Aβ-MCM)，每組包括5個(gè)不同時(shí)相：1h、3

8、h、6h、12h、24h。Real Time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中caspase-3 mRNA的表達(dá)。選取1/2 Aβ-MCM組，采用Hoechst33258染色，觀察神經(jīng)元的凋亡率。
　　用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，以最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較，以P＜0.05為有顯著性

9、差異。
　　結(jié)果：
　　1 Aβ1-40對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的作用及米諾環(huán)素對(duì)其作用的影響
　　應(yīng)用1μMAβ1-40作用于小膠質(zhì)細(xì)胞6h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNFα和IL-1β的含量明顯升高，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)；加入0.2μM米諾環(huán)素和Aβ1-40共同作用于小膠質(zhì)細(xì)胞后，明顯抑制了TNFα和IL-1β的升高，與Aβ處理組相比明顯下降。
　　應(yīng)用1μM Aβ1-40作用于小膠質(zhì)細(xì)胞6h后，小膠質(zhì)細(xì)胞中

10、TNFα、IL-1βmRNA的表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)；加入0.2μM米諾環(huán)素和Aβ1-40共同作用于小膠質(zhì)細(xì)胞后，明顯抑制了TNFα、IL-1β mRNA的表達(dá)，與Aβ處理組相比明顯下降。
　　2 Aβ-MCM對(duì)神經(jīng)元caspase-3 mRNA表達(dá)的影響
　　在神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入1/2量的Aβ-MCM后，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元caspase-3 mRNA的表達(dá)均升高，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜

11、0.05)，其中以6h時(shí)升高最明顯(P＜0.01)。在神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入1/4量和1/8量的Aβ-MCM，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元caspase-3 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。
　　3 Aβ-MCM對(duì)神經(jīng)元凋亡率的影響
　　應(yīng)用Hoechst33258染色觀察神經(jīng)元的凋亡率，結(jié)果顯示，1/2Aβ-MCM處理后各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)熒光強(qiáng)度較高的凋亡神經(jīng)元細(xì)胞核，并伴有染色質(zhì)的濃縮、聚集。隨機(jī)選取5個(gè)視野，300個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)并進(jìn)行