高脂血癥對(duì)靜脈移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞歸巢及骨再生的影響.pdf

1、背景和目的:
　　口腔頜面部的骨缺損多由良惡性腫瘤、手術(shù)、創(chuàng)傷以及炎癥（例如牙周炎、骨髓炎）等引起，不但導(dǎo)致患者的面部畸形和功能障礙，還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的心理、社交障礙，影響患者的生活質(zhì)量。理想的骨缺損修復(fù)是實(shí)現(xiàn)骨組織的再生，恢復(fù)健康骨組織的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能。骨損傷的愈合是一個(gè)復(fù)雜的組織學(xué)和生物化學(xué)變化過程，多種細(xì)胞和分子參與其中。在損傷后的第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)，血小板、巨噬細(xì)胞以及其他炎癥細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，募集間充質(zhì)干細(xì)胞

2、(mesenchymal stem cells，MSCs)到受損區(qū)域。這些間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)一步增殖分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的的積聚及礦化。間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞，具有自我復(fù)制和多向分化能力，可以在特定條件下轉(zhuǎn)變成為一種或多種構(gòu)成人體組織或器官的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。參與骨再生的間充質(zhì)干細(xì)胞可能來源于缺損臨近組織例如骨膜、骨髓、血管壁等，也可能由較遠(yuǎn)區(qū)域的骨髓組

3、織通過血液循環(huán)遷移至此，另外外周血中也存在少量間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞的激活、募集對(duì)骨損傷后的再生至關(guān)重要。
　　骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSCs)是一種多能干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新能力，能夠分化為多種中胚層組織如脂肪組織、骨組織、軟骨、韌帶、肌肉等。作為成骨前體細(xì)胞，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在骨組織形成過程中發(fā)揮著重要作用。干細(xì)胞通過血液循環(huán)穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞甚至是經(jīng)過長(zhǎng)距離的遷移到達(dá)特定部位的過

4、程稱之為“歸巢”。大量研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)選擇性的歸巢至機(jī)體任何損傷部位以發(fā)揮治療作用，確切機(jī)理尚不清楚。盡管越來越多的證據(jù)顯示細(xì)胞因子和趨化因子（以及他們的受體）可能在間充質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)員、歸巢過程中發(fā)揮著重要的作用，但鮮有研究關(guān)注干細(xì)胞歸巢與全身健康狀況的關(guān)系。
　　高脂血癥與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。高脂血癥通過抑制骨形成和促進(jìn)骨吸收導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化在其中起重要作用。脂質(zhì)氧化物能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡以及破骨細(xì)胞的

5、分化;骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)過低密度脂蛋白的氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)，能夠分化為脂肪細(xì)胞而不是成骨細(xì)胞。目前高脂血癥對(duì)骨創(chuàng)傷愈合的影響還不明確，但已有研究顯示高脂血癥抑制骨創(chuàng)傷部位的新骨形成。因此我們推測(cè):除了對(duì)骨代謝的負(fù)性影響外，高脂血癥還可能會(huì)通過干擾間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢行為影響骨創(chuàng)傷的愈合。
　　本實(shí)驗(yàn)利用載脂蛋白E基因敲除（Apolipoprotein E deficient，ApoE-/-）小鼠建立高脂血癥模型。在小鼠下頜骨制造骨缺損

6、后，經(jīng)過小鼠尾靜脈注射攜帶綠色熒光蛋白的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，利用免疫熒光顯微鏡觀察、免疫組化染色、組織學(xué)觀察以及組織形態(tài)學(xué)分析等方法首次探討了高脂血癥對(duì)系統(tǒng)移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的歸巢和骨再生的影響。
　　材料與方法:
　　1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和轉(zhuǎn)染
　　本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)C57BL/6J小鼠來源的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞;采用換液、粘附-消化-傳代-粘附的方法獲得高純度的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)

7、第4代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD34，CD44，CD45，CD29的表達(dá)。成纖維細(xì)胞克隆形成單位(CFU-F)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的克隆形成能力。三向分化能力鑒定:在體外以0.1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸鈉、50mg/L抗壞血酸磷酸鹽誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，4周后進(jìn)行茜素紅染色鑒定鈣化結(jié)節(jié)的形成;以1μM地塞米松、200μM吲哚美辛、10μM胰島素和0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化

8、，2周后用油紅O(OilRedO)染色檢測(cè)脂肪滴的形成;以10ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、50nM抗壞血酸磷酸鹽、0.1μM地塞米松誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，3周后通過甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)軟骨特異性蛋白聚糖的形成;體外分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)以不含誘導(dǎo)因子的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的同代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)照。利用攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein

9、，GFP)基因的慢病毒載體感染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)G418篩選陽性細(xì)胞后體外擴(kuò)增備用。
　　2.高脂血癥模型的建立及小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的移植
　　7周齡ApoE-/-小鼠和C57BL/6J小鼠均飼以高脂飲食，每周監(jiān)測(cè)體重，并于高脂喂養(yǎng)4周后檢測(cè)血脂水平以確定高脂模型是否建立。小鼠13周齡時(shí)，在其右側(cè)下頜骨制造直徑為1.5mm的缺損;收集體外擴(kuò)增的GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，每只小鼠接受的細(xì)胞移植量為1×10

10、6個(gè)，對(duì)照組僅注射不含血清的α-MEM培養(yǎng)液。術(shù)后1，2，4周處死小鼠，經(jīng)4％多聚甲醛循環(huán)內(nèi)固定后解剖出小鼠右側(cè)下頜骨。下頜骨標(biāo)本經(jīng)過外固定、EDTA脫礦后，進(jìn)行常規(guī)包埋切片。切片脫蠟水化后，用DAPI染色液行細(xì)胞核染色并通過熒光顯微鏡直接觀察GFP+細(xì)胞在體內(nèi)的遷移與分化，利用圖像處理軟件檢測(cè)移植細(xì)胞的歸巢效率，評(píng)價(jià)高脂血癥對(duì)移植細(xì)胞歸巢的影響;免疫組化染色的方法檢測(cè)攜帶GFP的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在骨缺損區(qū)的分布及分化;組織切片經(jīng)蘇木素一

11、伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色、馬松三色(Masson's Trichrome，MT)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察骨缺損區(qū)組織學(xué)變化，并利用圖像分析軟件測(cè)量新骨形成面積以評(píng)價(jià)高脂血癥對(duì)骨再生的影響。
　　結(jié)果:
　　1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和感染
　　利用全骨髓貼壁法可成功分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，原代細(xì)胞的純度較低，經(jīng)過2～3次傳代之后可以獲得純化，細(xì)胞大小、形態(tài)穩(wěn)定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)P

12、4代細(xì)胞表面標(biāo)記發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD44(96.48％)，CD29(97.98％);而不表達(dá)CD31(0.71％)和CD45(5.72％)。成纖維細(xì)胞克隆形成單位實(shí)驗(yàn)顯示骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的克隆形成能力。小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)4周后進(jìn)行茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)有致密紅染的細(xì)胞外基質(zhì)沉積和礦化結(jié)節(jié)的形成;脂向誘導(dǎo)2周后進(jìn)行油紅O染色，可見大量紅色脂滴形成;成軟骨誘導(dǎo)3周后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，觀察到細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有異染藍(lán)色，以上結(jié)果提示本實(shí)

13、驗(yàn)分離培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能。攜帶CFP基因的慢病毒感染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞48小時(shí)后，熒光顯微鏡下可觀察到大部分細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，96小時(shí)達(dá)到最強(qiáng);感染后的細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變，生長(zhǎng)狀態(tài)良好;經(jīng)過G418篩選獲得的GFP+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可大量擴(kuò)增，GFP隨細(xì)胞傳代持久、穩(wěn)定表達(dá)。
　　2.高脂血癥模型的建立及小鼠骨髓基質(zhì)千細(xì)胞的移植
　　ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)4周時(shí)的血脂水平較C57BL/6J小鼠明

14、顯升高，其中血清總膽固醇水平升高了8.1倍，低密度脂蛋白水平升高了14.4倍，而高密度脂蛋白和甘油三酯的血清水平僅升高了2.3和1.7倍，說明高脂血癥動(dòng)物模型成功建立;實(shí)驗(yàn)期間兩種小鼠的體重持續(xù)增長(zhǎng)，沒有明顯差異。免疫熒光顯微鏡直接觀察和免疫組化染色分析顯示，術(shù)后1周骨缺損部位GFP+細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣;2周和4周時(shí)GFP+細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，在骨缺損邊緣和新骨形成區(qū)檢測(cè)到GFP+成骨細(xì)胞;通過對(duì)GFP+細(xì)胞數(shù)

15、進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)并計(jì)算歸巢率，發(fā)現(xiàn)在相同的時(shí)間點(diǎn)高脂血癥小鼠的移植細(xì)胞歸巢率明顯低于C57BL/6J小鼠。HE、MT染色后的組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周所有動(dòng)物的骨缺損區(qū)均充滿纖維結(jié)締組織，沒有新骨形成;術(shù)后2周，骨缺損中央可見骨島形成;術(shù)后4周，可觀察到缺損區(qū)有大面積新骨形成。組織形態(tài)學(xué)分析顯示C57BL/6J小鼠比ApoE-/-小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的新骨生成能力，而接受BMSCs移植的小鼠其新骨形成面積比未接受細(xì)胞移小鼠相對(duì)較多，比較各組的新骨形成

16、面積均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞操作簡(jiǎn)單，易于掌握;細(xì)胞經(jīng)過換液、2～3次傳代后獲得純化。分離培養(yǎng)獲得的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，具備干細(xì)胞特性:擁有較強(qiáng)的克隆形成能力并能誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。攜帶GFP基因的慢病毒能夠有效的感染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，感染后的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能夠持久穩(wěn)定表達(dá)GFP，并于體外大量擴(kuò)增。
　　2.經(jīng)小鼠尾靜脈移植的骨