骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離及骨唾液酸蛋白對(duì)其向成骨細(xì)胞分化的影響.pdf

1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cells，BMSC)是一群存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能。體外分離培養(yǎng)BMSC，在一定的誘導(dǎo)條件下，BMSC可以定向分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞作為骨組織形成過(guò)程中的一種重要細(xì)胞，在骨缺損的修復(fù)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，特別對(duì)構(gòu)建用于修復(fù)骨缺損的組織工程骨尤其重要。骨鈣素(osteocalcin，OCN)和堿性磷酸酶(alkaline phosph

2、atase，ALP)表達(dá)水平可作為成骨細(xì)胞鑒定和功能狀態(tài)評(píng)價(jià)的指標(biāo)。 骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是一種細(xì)胞基質(zhì)中的非膠質(zhì)蛋白質(zhì)，BSP在骨發(fā)生時(shí)可啟動(dòng)礦化晶體的生長(zhǎng)，能夠介導(dǎo)成骨細(xì)胞與骨礦物質(zhì)的結(jié)合，與骨的分化、組織形成和再塑有關(guān)；同時(shí)BSP具有良好的成骨效應(yīng)。因此，研究BSP對(duì)BMSC向成骨細(xì)胞分化的影響及其作用機(jī)制，有可能為組織工程骨在臨床的推廣應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。本課題用改良的骨髓培養(yǎng)法體

3、外分離、擴(kuò)增培養(yǎng)BMSC；定向誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，進(jìn)行成骨鑒定。通過(guò)添加rhBSP和真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPCI-mBSP轉(zhuǎn)染BMSC，初步研究。BSP對(duì)BMSC成骨分化的影響。主要研究結(jié)果如下： 1．通過(guò)改良的骨髓培養(yǎng)法原代培養(yǎng)BMSC，不但提高了BMSC的分離率和增殖能力，而且使分離時(shí)間縮短、污染機(jī)會(huì)減少、工作效率提高。 2．分離培養(yǎng)的大鼠、小鼠BMSC均呈纖維狀，梭形，有突起，約7～9d時(shí)，細(xì)胞匯合成片，其融

4、合率可達(dá)到80％；消化傳代后的細(xì)胞較原代細(xì)胞體積大，呈不規(guī)則的多角形，有短而薄的胞質(zhì)突起，且貼壁較快，12h后貼壁率可達(dá)80％以上；小鼠BMSC超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出早期細(xì)胞的特點(diǎn)。不同密度接種小鼠BMSC結(jié)果顯示，最佳接種密度為1×10<'4>～6×10<'4>個(gè)/mL。小鼠BMSC傳代后細(xì)胞第1～3d處于潛伏適應(yīng)期；第4～8d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；而后增殖相對(duì)緩慢開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。細(xì)胞周期檢測(cè)顯示，100％細(xì)胞都是二倍體，88％以上的細(xì)胞處于靜

5、止期細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞處于增殖活躍期。STRO-1免疫組化和免疫熒光細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，所分離培養(yǎng)的小鼠、人BMSC胞漿中表達(dá)STRO-1。 3．定向誘導(dǎo)小鼠BMSC、大鼠BMSC向成骨細(xì)胞分化，10d～12d時(shí)細(xì)胞間出現(xiàn)了較多散在的致密圓形礦化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周?chē)募?xì)胞密度較高，輪廓不清，結(jié)節(jié)中心透光性差，符合成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。成骨誘導(dǎo)2周的第1代小鼠BMSC的細(xì)胞周期結(jié)果顯示，100％細(xì)胞都是二倍體，其中S+G<,2>期細(xì)胞

6、約占11.72％，而處于G<,l>期的細(xì)胞約占87.28％，即誘導(dǎo)的細(xì)胞大部分處于分裂前的靜止期。成骨誘導(dǎo)2周的大鼠BMSC的OCN表達(dá)呈明顯陽(yáng)性。小鼠和大鼠BMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)2周后，ALP染色為陽(yáng)性，并隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)；同時(shí)細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)，出現(xiàn)Von kossa染色陽(yáng)性的礦化結(jié)節(jié)，提示礦化基質(zhì)沉積。 4．小鼠BMSC中添加rhBSP的最佳濃度為10<'-10>mol/L～10<'-11>mol/L，對(duì)BMSC的生長(zhǎng)起一定

7、的促進(jìn)作用，但是隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨誘導(dǎo)劑促進(jìn)BMSC的成骨分化，而相對(duì)抑制其增殖。小鼠BMSC經(jīng)含rhBSP的成骨誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)，并出現(xiàn)不透明結(jié)節(jié)；Von Kossa染色可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)顆粒變大，數(shù)量增多，礦化基質(zhì)沉積明顯，初步提示rhBSP具備促進(jìn)組織礦化、成骨細(xì)胞與礦化基質(zhì)結(jié)合的功能，表明rhBSP具有良好的成骨誘導(dǎo)性。真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPCI-mBSP通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染小鼠BMSC，轉(zhuǎn)染36