內(nèi)源性HMGB1介導(dǎo)的自噬反應(yīng)對白血病細胞化療敏感性的影響及機制研究.pdf

1、急性白血病(acuteleukemia，AL)是兒童及青少年時期最常見的惡性腫瘤，化療是其主要的治療手段，而化療敏感性降低及耐藥產(chǎn)生所致的化療失敗和復(fù)發(fā)是白血病治療中面臨的主要困難。近年來學(xué)術(shù)界普遍認為，白血病耐藥是多因素、多種機制共同作用的結(jié)果，但具體機制尚不明確。因此，揭示白血病發(fā)病及耐藥的作用機制，尋找新的治療干預(yù)靶點，對于提高白血病患兒的長期無事件生存率（event-freesurvival，EFS）具有非常重要的意義。高遷移率

2、族蛋白B1(highmobilitygroupbox1protein，HMGB1)是一種保守的非組蛋白核蛋白，在穩(wěn)定染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用。本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性HMGB1通過自噬介導(dǎo)了白血病細胞化療耐藥的形成，目前尚不清楚內(nèi)源性HMGB1能否通過自噬影響白血病細胞的化療敏感性。
　　 本研究首先收集了AL患兒的骨髓單個核細胞(bonemarrowmononuclearcells，BMMCs)和多種

3、細胞株，通過反轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)和蛋白印跡方法(westernblotting)方法分別對30例急性淋巴細胞性白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)患兒、11例急性非淋巴細胞性白血病(acutenon-lymphocyticleukemia,ANLL)患兒和不同細胞株中內(nèi)源性HMGB1的表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)初

4、治及復(fù)發(fā)期的HMGB1mRNA相對表達水平明顯高于緩解期。同時，通過對多種細胞株的mRNA和蛋白分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1在白血病細胞株（K562，HL-60和Jurkat）和其它多種實體瘤細胞中的表達較非腫瘤細胞顯著增高，表明內(nèi)源性HMGB1可能參與了兒童AL的發(fā)病，且HMGB1的表達水平與AL的病程相關(guān)。進一步探討了內(nèi)源性HMGB1對白血病細胞化療敏感性的影響。以Jurkat和K562細胞為研究對象，通過基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾（RNAint

5、erference，RNAi）技術(shù)和westernblotting、四甲基偶氮唑藍(methylthiazolyltertrazolium，MTT)染色實驗等方法，發(fā)現(xiàn)下調(diào)HMGB1表達能明顯增強白血病細胞的化療敏感性;相反，上調(diào)HMGB1表達降低了白血病細胞的化療敏感性。
　　 其次，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性HMGB1能夠通過介導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生影響白血病細胞的化療敏感性。不同的藥物處理K562細胞后，westernblotting檢測

6、發(fā)現(xiàn)化療藥物能明顯增加細胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3)-Ⅱ的表達水平，且與Hank's平衡鹽溶液（Hank'sbalancedsaltsolution，HBSS）饑餓誘導(dǎo)相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。進一步以HBSS誘導(dǎo)自噬為研究模型，通過基因轉(zhuǎn)染、RNAi技術(shù)和westernblotting、透射電鏡等實驗方法，發(fā)現(xiàn)上調(diào)HMGB1表達能顯著增

7、加LC3-Ⅱ、Beclin1表達和自噬泡的形成;相反，下調(diào)HMGB1表達能夠降低LC3-Ⅱ和Beclin1表達和自噬泡的形成;且HMGB1基因沉默的白血病細胞予以溶酶體酶抑制劑(PA/E64D)干預(yù)后，并不能增加細胞中LC3-Ⅱ的表達，表明HMGB1上調(diào)的自噬反應(yīng)并不是由于溶酶體被抑制后LC3-Ⅱ消耗減少所致，而是由HMBG1本身所觸發(fā)的自噬潮（autophagyflux）產(chǎn)生。同時，自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤（3-methyla

8、denine，3-MA）干預(yù)后能明顯抑制LC3-Ⅱ和自噬體的表達，通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HMGB1基因的白血病細胞經(jīng)3-MA預(yù)處理后能明顯增強其化療敏感性，提示HMGB1通過調(diào)節(jié)自噬對白血病細胞的化療敏感性起著重要的作用。
　　 最后，闡明了磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalianta

9、rgetofrapamycin，mTOR)信號途徑可能是HMGB1調(diào)節(jié)白血病細胞自噬的主要途徑之一。通過對白血病細胞HMGB1基因轉(zhuǎn)染及RNAi，發(fā)現(xiàn)增加HMGB1基因表達后能顯著抑制Akt以及mTOR下游p70S6K蛋白的磷酸化水平;相反，抑制HMGB1表達后進一步激活了Akt磷酸化，且能逆轉(zhuǎn)饑餓誘導(dǎo)下mTOR/raptor復(fù)合物之間的相互作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制Akt上游PI3K-Ⅰ基因后，下調(diào)HMGB1表達不能降低饑餓誘導(dǎo)下LC