RNAi抑制XIAP表達(dá)對白血病細(xì)胞凋亡及化療藥物敏感性的影響.pdf

1、背景與目的： 白血病是一類異質(zhì)性造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病。目前造血干細(xì)胞移植被認(rèn)為是治愈急性白血病唯一有效的方法，但是存在HLA相合配型難及費(fèi)用昂貴等問題，藥物的化療仍是急性白血病治療的主要手段。近年來隨著聯(lián)合化療方案的不斷改進(jìn)，白血病的完全緩解率得到了很大提高，但仍有部分患者存在初發(fā)難治、復(fù)發(fā)等問題，其主要原因是白血病細(xì)胞存在原發(fā)及繼發(fā)耐藥。因此尋找提高白血病對化療藥物敏感性的方法，加強(qiáng)白血病輔助治療的效果，對于改善白血病的預(yù)

2、后具有十分重要的意義。 凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的細(xì)胞內(nèi)源性凋亡抑制蛋白家族。X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（X—linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）被認(rèn)為是IAPs中抗凋亡作用最強(qiáng)的成員之一。研究發(fā)現(xiàn)XIAP參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的化療耐藥密切相關(guān)。目前為止，關(guān)于XIAP的表達(dá)與腫瘤的

3、預(yù)后及化療耐藥的研究仍有爭議，尚不明確下調(diào)XIAP的表達(dá)是否能改善白血病細(xì)胞對化療藥物的敏感性以及相關(guān)機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)通過觀察三種白血病細(xì)胞株及正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC） XIAP的表達(dá)水平，探討XIAP在白血病細(xì)胞中的表達(dá)情況。設(shè)計(jì)合成具有良好沉默效應(yīng)的XIAP小分子干擾RNA（smallinterfering RNA，siRNA），研究應(yīng)用siRNA抑

4、制白血病細(xì)胞XIAP表達(dá)的可行性，觀察下調(diào)XIAP后細(xì)胞對化療藥物敏感性的變化，初步探討其機(jī)制。 方法： 1、培養(yǎng)人慢性髓性白血病細(xì)胞K562、人急性早幼粒白血病細(xì)胞HL—60、人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞MOLT—4，分離正常人PBMC，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測四種細(xì)胞中XIAP mRNA和XIAP蛋白的表達(dá)情況。 2、針對XIAP mRNA體外化學(xué)合成siRNA，采用Nucleo f

5、ectorTM核酸轉(zhuǎn)染儀對XIAP高表達(dá)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染XIAP siRNA，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中XIAP mRNA和XIAP蛋白的表達(dá)情況。檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在不同濃度化療藥物作用下的抑制情況，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration50，IC50），比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對化療藥物敏感性的變化，觀察其變化是否通過XIAP表達(dá)下調(diào)起作用。用流式細(xì)胞儀及Hoch

6、est染色法檢測細(xì)胞凋亡，了解細(xì)胞凋亡與細(xì)胞對化療藥物敏感性的關(guān)系。 結(jié)果： 1、MOLT—4、HL—60、K562細(xì)胞中XIAP mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯高于正常人PBMC（P＜0．05），其中K562細(xì)胞XIAP的表達(dá)量最高（P＜0．05）。 2、應(yīng)用XIAP siRNA及陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，陰性對照組、空白細(xì)胞組、單純電擊組間XIAP表達(dá)無明顯差異（P＞0．05）；實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組比較，

7、轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h XIAP mRNA及蛋白水平均有明顯下調(diào)（P＜0．05），48h下調(diào)效果最明顯。 3、在不加化療藥物的條件下，實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白細(xì)胞組、單純電擊組四組間比較，細(xì)胞凋亡率和caspase—3活性無明顯差異（P＞0．05）。加入化療藥后，陰性對照組、空白細(xì)胞組、單純電擊組三組間比較，細(xì)胞凋亡率和caspase—3活性無明顯差異（P＞0．05）；實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組比較，細(xì)胞凋亡率和caspase—3

8、活性明顯升高（P＜0．05）。加入化療藥后，Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組含有的核皺縮，濃染和碎裂等凋亡形態(tài)的細(xì)胞明顯增多。 4、應(yīng)用XIAP siRNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組比較，阿糖胞苷和依托泊苷對細(xì)胞的IC50明顯下降（P<0．05）。 結(jié)論： 1、XIAP在白血病細(xì)胞-MOLT-4、HL-60、K562內(nèi)高表達(dá)，其中K562細(xì)胞XIAP的表達(dá)水平最高。 2