凋亡抑制基因XIAP在食管癌中的表達(dá)及RNAi下調(diào)其在食管癌中表達(dá)對化療敏感性影響的研究.pdf

1、目的： 食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，在地區(qū)間差別較大。它的特征是早期診斷比較困難且預(yù)后差，我國食管癌的發(fā)病率目前居世界第一位，發(fā)病人數(shù)占發(fā)病總數(shù)的60％，且男性的發(fā)病率是女性的2倍。全世界每年新發(fā)食管癌病例約30萬。我國食管癌發(fā)病率為13/10萬，但是食管癌的確切發(fā)病機制尚不明確，且對于食管癌的治療主要是手術(shù)治療為主聯(lián)合放療和化療的綜合治療，但是現(xiàn)有方法已經(jīng)達(dá)到其治療的極限，只有深入研究其發(fā)病機制，并尋找新的治療

2、方式才能提高食管癌的治愈率。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與其凋亡率降低有關(guān)，最重要的凋亡通路就是Caspase通路。X染色體連鎖的凋亡抑制基因(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是凋亡抑制基因家族中重要的成員之一，其編碼的蛋白XIAP通過選擇性的抑制Caspase-3，-7和-9，并參與其它途徑來抑制細(xì)胞的凋亡，XIAP是該基因家族中唯一能夠同時抑制起始和效應(yīng)階段的IAP。本研究擬在

3、探索XIAP與食管癌之間的關(guān)系，從三個方面探討XIAP與食管癌的發(fā)生發(fā)展以及對食管癌化療敏感性的影響。 第一，通過免疫組化、RT-PCR和Westem Blot檢測XIAP在食管鱗癌和正常食管組織中的表達(dá)，并檢測其在多株食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況； 第二，通過化學(xué)合成法合成的XIAP特異的siRNA，觀察能否通過RNAi方法降低XIAP在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)： 第三，若能通過RNAi方法降低食管癌細(xì)胞中XIAP的表

4、達(dá)，探討XIAP低表達(dá)對食管癌細(xì)胞凋亡的影響，更重要的是觀察其對多種化療藥物敏感性影響。 材料與方法： 1、臨床標(biāo)本及組織芯片制作：食管鱗癌及癌旁正常食管配對組織取自安徽醫(yī)科大學(xué)胸外科，由2位以上資深病理學(xué)家診斷為食管鱗癌，所有病人術(shù)前均未經(jīng)放化療。新鮮組織采用手術(shù)分離，并在術(shù)后立即置于液氮中凍存，選取110對食管癌配對組織常規(guī)石蠟包埋。 組織芯片在Beecher組織芯片儀制作完成，在蠟塊上設(shè)計14×7共98點組

5、織陣列，打孔并將供體蠟塊標(biāo)記部位取出的組織柱推入預(yù)先設(shè)計的相應(yīng)孔內(nèi)；對蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，裱于防脫片載玻片上。 2、食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)：本研究中選用的人食管鱗癌細(xì)胞系，其中TE10、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE450、KYSE510細(xì)胞系由日本Kyoto University的ShimadaY博士惠贈，EC9706由王明榮教授惠贈。食管癌細(xì)胞被培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中，這個培養(yǎng)基含有10

6、％胎牛血清，不含有抗生素，生長環(huán)境是5％CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3、siRNA合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：XIAP-siRNA由Invitrogen公司設(shè)計合成，并在Hela細(xì)胞中驗證其對XIAP的抑制效率。我們采用脂質(zhì)體法，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRNA轉(zhuǎn)染濃度為25nm。 4、RT-PCR半定量法檢測XIAP在組織標(biāo)本和細(xì)胞中的表達(dá)：食管癌組織、癌旁正常食管組織和食管癌細(xì)胞均按Tr

7、izol法提取總RNA，然后進(jìn)行RT-PCR，最終的結(jié)果應(yīng)用Gel-pro Analyzer軟件進(jìn)行半定量分析。 5、Western Blot半定量法檢測XIAP在組織標(biāo)本和細(xì)胞中的表達(dá)：食管癌組織、癌旁正常食管組織和食管癌細(xì)胞按照常規(guī)方法提取胞漿總蛋白，進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行Western Blot，最終的結(jié)果應(yīng)用Gel-pro Analyzer軟件進(jìn)行半定量分析。 6、免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果分析：采用微波法修復(fù)抗原，應(yīng)

8、用ABC免疫組化試劑盒按照ABC法進(jìn)行免疫組化染色，免疫組化染色結(jié)果采用二級記分法進(jìn)行判定，結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)生分別獨立完成，取二者平均值作為最終結(jié)果。 7、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：同時收集懸浮和貼壁生長的細(xì)胞，PI法染色，應(yīng)用FACSCalibur flow cytometer流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件進(jìn)行結(jié)果分析，sub-G1-G0區(qū)細(xì)胞被認(rèn)定為凋亡細(xì)胞。 8、化療藥物處理及MTT法檢測細(xì)胞活性：按照

9、實驗設(shè)計對接種于96孔板的細(xì)胞進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，并加入相應(yīng)濃度的化療藥物，在設(shè)定的時間點應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞活性。 9、應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，XIAP在食管癌和正常組織表達(dá)的差異應(yīng)用非配對T檢驗進(jìn)行，XIAP的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系用卡方檢驗和Sperman’s相關(guān)分析進(jìn)行分析。IC50的計算采用Probit分析法計算，不同組之間的均數(shù)比較采用Student-Neuman-Keuls多樣本均數(shù)檢驗進(jìn)行分析

10、。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、首先我們通過免疫組織化學(xué)、RT-PCR和Wesern Blot的方法檢測XIAP mRNA和XIAP蛋白在食管鱗癌組織、癌旁正常食管組織和食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)，不同的方法檢測的結(jié)果一致顯示其在食管癌組織中的表達(dá)顯著高于其在正常食管組織中的表達(dá)(統(tǒng)計分析均顯示P<0.01)，同樣其在大多數(shù)食管癌細(xì)胞系中高表達(dá)，但是其在食管癌組織中的表達(dá)與食管癌患者的臨床病理因素如：患者的年齡

11、、性別、食管癌的分化程度和TNM分期無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)。 2、選擇了兩株XIAP高表達(dá)細(xì)胞系KYSE150、EC9706和兩株XIAP低表達(dá)細(xì)胞系TE10、KYSE510，進(jìn)行XIAP-siRNA轉(zhuǎn)染，選取轉(zhuǎn)染后24小時、48小時和72小時三個時間點，通過RT-PCR和Westem Blot檢測發(fā)現(xiàn)，XIAP-siRNA在mRNA和蛋白水平均能夠有效地降低XIAP的表達(dá)，對XIAP的抑制率可以達(dá)到90％以上。 3、應(yīng)用XIA

12、P-siRNA進(jìn)行RNA干擾后食管癌細(xì)胞XIAP低表達(dá)，我們檢測了其對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示在XIAP高表達(dá)細(xì)胞系，XIAP的表達(dá)降低能夠顯著增加細(xì)胞的凋亡，而在XIAP低表達(dá)細(xì)胞系中XIAP的低表達(dá)對細(xì)胞的凋亡率沒有影響(P<0.01)，這兩方面結(jié)果提示食管癌細(xì)胞凋亡的增加確實是由XIAP的表達(dá)降低引起的。 4、在研究XAIP低表達(dá)后對食管癌細(xì)胞化療敏感性的影響中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在XIAP高表達(dá)細(xì)胞系KYSE150、EC9706

13、中，降低XIAP的表達(dá)能夠顯著增加所有細(xì)胞對所有化療藥物紫杉醇(PTX)、順鉑(DDP)、依托泊苷(VP-16)和氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性；而對于XIAP低表達(dá)系，在TE10僅能增加對四種中的三種化療藥物紫杉醇(PTX)、順鉑(DDP)和依托泊苷(VP-16)的敏感性，在KYSE150中僅能增強對紫杉醇(PTX)敏感性，且這兩株細(xì)胞中，XIAP低表達(dá)對化療藥物敏感性的增加遠(yuǎn)不如在XIAP高表達(dá)細(xì)胞系中顯著。 結(jié)論：

14、1、X染色體連鎖的凋亡抑制基因XIAP在食管鱗癌組織中明顯高于其在正常食管組織中的表達(dá)，但是與患者的臨床病理因素(年齡、性別、食管癌的分化程度和TNM分期)無關(guān)，基于此，可為食管鱗癌的病理診斷提供了一個新的免疫組織化學(xué)指標(biāo)，可能會對食管癌的診斷提供一定的輔助作用。 2、XIAP特異的siRNA能夠顯著降低食管癌細(xì)胞中XIAP的表達(dá)，在降低XIAP后，能夠顯著增加XIAP高表達(dá)食管癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步驗證了XIAP主要通過Cs