下調(diào)HMGB1表達(dá)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌TE-1細(xì)胞放療敏感性的影響和機(jī)制研究.pdf

1、【目的】探討HMGB1表達(dá)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌TE-1細(xì)胞放療敏感性的影響，并初步探討其分子調(diào)控機(jī)制。
　　【方法】
　?。?）應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過Lipofectamine2000分別將空載體陰性對(duì)照（NC siRNA）和HMGB1干擾載體（siHMGB1）轉(zhuǎn)染至人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE-1，按不同分組標(biāo)記為：TE-1組（空白對(duì)照組），TE-1+NC siRNA組（空載體陰性對(duì)照組），TE-1+siHMGB1組（HM

2、GB1沉默組）；通過實(shí)時(shí)定量PCR法檢測各組TE-1細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA的表達(dá)變化，Western blot法進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染TE-1細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達(dá)改變；
　?。?）對(duì)上述三組TE-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）X射線照射培養(yǎng)一定的時(shí)間（24、48、72、96小時(shí)），通過MTT法檢測TE-1細(xì)胞的增殖率；
　?。?）對(duì)上述三組TE-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行上述不同劑量X射線照射后培養(yǎng)15天，

3、通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測TE-1細(xì)胞的克隆形成率；
　?。?）上述轉(zhuǎn)染處理24小時(shí)，給予4 Gy X射線照射后，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組TE-1細(xì)胞的凋亡率、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量和γH2AX水平；用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測各組TE-1細(xì)胞NOX1與NOX5 mRNA的表達(dá)變化；Western blot法檢測各組TE-1細(xì)胞Caspase-3、Cleaved PARP、p38、p-p38、JNK、

4、p-JNK蛋白的表達(dá)變化。
　　【結(jié)果】
　　（1）HMGB1沉默組TE-1細(xì)胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)量均較空白對(duì)照組、空載體陰性對(duì)照組顯著降低（均P<0.001）；
　?。?）MTT法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24、48、72、96小時(shí)HMGB1沉默組TE-1細(xì)胞增殖率低于空白對(duì)照組及空載體陰性對(duì)照組（均P<0.05）；轉(zhuǎn)染后24小時(shí)行4 Gy X射線照射24、48、72、96小時(shí)后，轉(zhuǎn)染前后三組TE-1細(xì)胞的增

5、殖能力均受到抑制，而HMGB1沉默組TE-1細(xì)胞增殖抑制程度較其他兩組明顯（均P<0.05）；轉(zhuǎn)染后24小時(shí)經(jīng)不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）的X射線照射48小時(shí)后：隨著X射線照射劑量的增加，三組TE-1細(xì)胞的增殖率均降低， HMGB1沉默組細(xì)胞增殖抑制較兩對(duì)照組明顯（均P<0.05）；
　　（3）Sigmaplot軟件分析結(jié)果顯示HMGB1沉默組D0、Dq、N值均低于空白對(duì)照組和空載體陰性對(duì)照組；HMGB1沉默組相對(duì)于空白對(duì)

6、照組的放射增敏比（ sensitizingenhancement ratio，SER）為1.26；
　　（4）流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，HMGB1沉默組凋亡率、ROS含量和γH2AX水平高于兩對(duì)照組；實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示HMGB1沉默組NOX1和NOX5 mRNA的表達(dá)高于兩對(duì)照組；Western blot檢測結(jié)果顯示HMGB1沉默組Caspase-3、Cleaved PARP、p-p38、p-JNK蛋白的表達(dá)

7、高于兩對(duì)照組（均P<0.05）；轉(zhuǎn)染后24小時(shí)起給予4 Gy X射線照射，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示HMGB1沉默組凋亡率、ROS含量和γH2AX水平高于單純放療組；實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示HMGB1沉默組NOX1與NOX5 mRNA的表達(dá)高于單純放療組；Western blot檢測結(jié)果顯示 HMGB1沉默組Caspase-3、Cleaved PARP、p-p38、p-JNK蛋白的表達(dá)高于單純放療組（均P<0.05）。
　　【結(jié)論】

8、
　　通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)下調(diào)HMGB1表達(dá)能抑制人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE-1放療后的增殖率，降低其克隆形成能力，即下調(diào)HMGB1表達(dá)能提高TE-1細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。其分子機(jī)制是下調(diào) HMGB1表達(dá)可能通過上調(diào)促細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3/Cleaved PARP的表達(dá)以及上調(diào)ROS產(chǎn)生來影響DNA損傷，并通過JNK和p38通路激活，上調(diào)p-p38和p-JNK蛋白表達(dá)，調(diào)控放療對(duì)TE-1細(xì)胞增殖和凋亡能力改變，進(jìn)