缺營(yíng)養(yǎng)誘發(fā)膽管癌細(xì)胞自噬對(duì)化療藥物敏感性影響及機(jī)制研究.pdf

1、膽管癌(Cholangiocarcinoma)是全球常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。膽管癌的治療目前仍是以手術(shù)為主的綜合治療，手術(shù)為其首選治療方法，但由于腫瘤分化程度低，惡性度高，使得手術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。而晚期腫瘤患者，已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，治療以放化療為主，但膽管癌對(duì)放化療不敏感，治療效果差，預(yù)后不佳。因此，研究膽管癌對(duì)化療的不敏感性對(duì)提高膽管癌的療效以及提高病人生存率有很重要的意義。
　　 雖然目前對(duì)膽管癌的耐藥機(jī)

2、制研究較多，但確切的機(jī)制仍不清楚。新近研究表明，細(xì)胞自噬可能與腫瘤的耐藥有關(guān)。細(xì)胞對(duì)自噬的形成有著精細(xì)的調(diào)節(jié)，這過程有多種基因的參與，這些基因稱為自噬相關(guān)基因atg(autophagy related gene)，它們編碼的蛋白參與自噬的誘導(dǎo)、產(chǎn)生、成熟和再循環(huán)，同時(shí)自噬還受到一些信號(hào)途徑如PI-3K/AKT/mTOR及p38-MAPK等的調(diào)控。自噬的過程受一系列復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控，自噬異常與腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性疾病、衰老等有重要的聯(lián)系。p

3、53是一種著名的腫瘤抑制基因以及功能蛋白，對(duì)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著非常重要的作用。但在所有惡性腫瘤中，僅有50％左右會(huì)出現(xiàn)該基因的突變，其他的發(fā)病機(jī)制尚不明確。有研究表明，在p53表達(dá)而引起細(xì)胞凋亡的情況下，只有在未發(fā)生細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬。所以，在缺血缺營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，膽管癌細(xì)胞的凋亡逃逸乃至對(duì)化療藥物的抵抗，極有可能由自噬介導(dǎo)并有p53基因的參與。為證實(shí)這一猜想，本課題從以下兩方面進(jìn)行研究：第一部分研究缺血缺營(yíng)養(yǎng)對(duì)膽管癌細(xì)胞

4、化療敏感性的影響；第二部分研究在缺血缺營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中p53參與的自噬在膽管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感中的作用機(jī)制。
　　 本研究首先將膽管癌細(xì)胞系(QBC)培養(yǎng)在全營(yíng)養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，分別用化療藥物(5FU、順鉑)處理12h，利用cck8法檢測(cè)細(xì)胞活性，用DAPI染色來檢測(cè)細(xì)胞死亡，以全營(yíng)養(yǎng)和缺營(yíng)養(yǎng)情況下未用藥的對(duì)照組為基準(zhǔn)，比較不同營(yíng)養(yǎng)情況下膽管癌細(xì)胞在化療藥作用下的死亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺營(yíng)養(yǎng)情況下膽管癌細(xì)胞

5、對(duì)化療藥物的敏感性降低。由于缺血缺營(yíng)養(yǎng)是細(xì)胞發(fā)生自噬的天然誘導(dǎo)劑，新近的研究表明自噬與腫瘤對(duì)化療不敏感有關(guān)，這些研究提示我們，自噬可能參與了膽管癌細(xì)胞對(duì)化療的抗性，因此我們進(jìn)一步研究膽管細(xì)胞癌缺營(yíng)養(yǎng)是否誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。
　　 隨后，將膽管癌細(xì)胞系(QBC)培養(yǎng)在全營(yíng)養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，應(yīng)用電子透射顯微鏡檢測(cè)自噬小體，比較不同營(yíng)養(yǎng)情況下自噬的表達(dá)情況。同時(shí)我們也利用轉(zhuǎn)染LC3-GFP質(zhì)粒檢測(cè)和比較不同

6、營(yíng)養(yǎng)情況下膽管癌細(xì)胞成點(diǎn)狀綠色熒光的數(shù)量；結(jié)果表明，膽管癌細(xì)胞在缺營(yíng)養(yǎng)情況下自噬小體的形成數(shù)量要高于全營(yíng)養(yǎng)情況，同時(shí)成點(diǎn)狀綠色熒光的數(shù)量也明顯增多。這些結(jié)果表明膽管細(xì)胞癌在缺營(yíng)養(yǎng)情況下誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。
　　 對(duì)膽管癌自噬的進(jìn)一步的研究還證實(shí)抑制自噬增加腫瘤細(xì)胞在缺營(yíng)養(yǎng)情況下的死亡率和對(duì)化療的敏感性。將膽管癌細(xì)胞系(QBC)培養(yǎng)在全營(yíng)養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，預(yù)先應(yīng)用自噬抑制劑(3MA)作用2h，分別用化療

7、藥物(5FU、順鉑)處理12h，利用cck8法檢測(cè)細(xì)胞活性，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，用DAPI染色來檢測(cè)細(xì)胞凋亡，比較和觀察在全營(yíng)養(yǎng)、缺營(yíng)養(yǎng)及缺營(yíng)養(yǎng)加自噬抑制劑情況下，腫瘤細(xì)胞的死亡情況以及在化療藥物作用下的死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抑制自噬和缺營(yíng)養(yǎng)的情況下，腫瘤細(xì)胞死亡增加，同時(shí)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性也增加。
　　 綜合上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們的研究表明自噬不但是膽管癌細(xì)胞在缺營(yíng)養(yǎng)情況下的生存機(jī)制之一，同時(shí)也有助于膽管

8、癌細(xì)胞抵抗的化療的作用。但是目前關(guān)于自噬抵抗化療的具體機(jī)制還不是很清楚。自噬是體內(nèi)唯一的一個(gè)降解細(xì)胞器的途徑，同時(shí)已有研究也顯示p53在腫瘤細(xì)胞的自噬發(fā)生過程起到很重要的作用。因此在膽管癌細(xì)胞中我們關(guān)注p53在自噬誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感中的作用。
　　 在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們將膽管癌細(xì)胞系(QBC)培養(yǎng)在全營(yíng)養(yǎng)和自噬誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中，預(yù)先應(yīng)用p53抑制劑PFT-a作用1h，然后繼續(xù)培養(yǎng)在全營(yíng)養(yǎng)和自噬

9、誘導(dǎo)培養(yǎng)基EBSS(無氨基酸無血清)中12h。應(yīng)用電子透射顯微鏡檢測(cè)自噬小體的形成。同時(shí)我們也利用轉(zhuǎn)染LC3-GFP質(zhì)粒檢測(cè)和比較p53抑制和未抑制情況下膽管癌細(xì)胞成點(diǎn)狀綠色熒光的數(shù)量；結(jié)果表明，膽管癌細(xì)胞在缺營(yíng)養(yǎng)聯(lián)合p53抑制情況下自噬小體的形成數(shù)量低于p53未抑制情況，同時(shí)成點(diǎn)狀綠色熒光的數(shù)量也明顯減少。進(jìn)一步的研究還顯示在p53抑制聯(lián)合缺營(yíng)養(yǎng)的情況下，分別用化療藥物(5FU、順鉑)處理24h，利用cck8法檢測(cè)細(xì)胞活性，在相差顯微

10、鏡倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，用DAPI染色來檢測(cè)細(xì)胞凋亡，比較和觀察在全營(yíng)養(yǎng)、缺營(yíng)養(yǎng)及缺營(yíng)養(yǎng)加自噬抑制劑情況下，腫瘤細(xì)胞的死亡情況以及在化療藥物作用下的死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺營(yíng)養(yǎng)的情況下抑制p53增加腫瘤細(xì)胞死亡，同時(shí)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性也增加。這個(gè)結(jié)果表明p53的激活可能參與了膽管癌對(duì)化療的不敏感。
　　 綜上所述，本課題得出以下結(jié)論：
　　 1、營(yíng)養(yǎng)缺乏能誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞激活自噬，自噬能誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞對(duì)