多西他賽Pluronic P123膠束制劑的研究.pdf

1、多西他賽(docetaxel,DTX)是一種半合成的紫杉烷類抗腫瘤藥物,是由歐洲紅豆杉屬植物漿果紫衫(Europeanyew tree,Taxus baccata)的針葉中提取或半合成的。多西他賽是一種細胞微管解聚抑制劑,其抗癌活性比紫杉醇強2-4倍。其抗癌譜廣,適用于多種癌癥的治療包括晚期和轉(zhuǎn)移性乳腺癌、卵巢癌、小細胞肺癌和非小細胞肺癌、頭頸癌和前列腺癌等。與其他紫杉烷類化合物如紫杉醇類似,多西他賽顯示出低的水溶性。為了臨床應(yīng)用,現(xiàn)有

2、注射劑泰索帝(R)(Taxotere(R))由高濃度的聚山梨酯80組成。據(jù)報道,聚山梨酯80能引起一些不良反應(yīng),如超敏反應(yīng),限制了多西他賽的臨床應(yīng)用。
　　近年來,聚合物膠束引起了藥物制劑研究者的廣泛關(guān)注。聚合物膠束由兩親性嵌段共聚物在水性介質(zhì)中自組裝形成,疏水性嵌段形成內(nèi)核,親水性嵌段構(gòu)成外殼。聚合物膠束是一種膠體載體,具有多種優(yōu)勢,包括納米級粒徑(在10-100nm范圍內(nèi)),增溶難溶性藥物,控制藥物釋放,延長體內(nèi)循環(huán)時間,逃離

3、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)或單核吞噬細胞系統(tǒng)的識別和攝取,EPR效應(yīng)介導(dǎo)的被動靶向作用。藥物分子可通過物理包封、化學(xué)鍵合和靜電相互作用等手段承載于聚合物膠束的內(nèi)核。
　　為了提高多西他賽的溶解度,和避免使用聚山梨酯80,本文制備了多西他賽膠束制劑。本課題選擇Pluronic嵌段共聚物作為載體材料,其具有無毒、無免疫原性、生物相容性。此外,據(jù)報道,Pluronic嵌段共聚物能抑制P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排作用,逆轉(zhuǎn)藥物的多藥耐藥性,提高藥物的活性。

4、其中,PluronicP123(PE020-b-PP070-b-PE020)具有較高的疏水嵌段比例,期待得到較高的載藥量。分別采用物理包封和化學(xué)鍵合方法將多西他賽承載于Pluronic P123聚合物膠束的疏水內(nèi)核,考察了其體外理化性質(zhì),并研究了其體內(nèi)外抗腫瘤活性,為多西他賽的膠束制劑開發(fā)提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。本課題主要分兩部分研究了多西他賽的Pluronic P123膠束制劑,主要的實驗方法和結(jié)果如下:
　　1.物理包封多西

5、他賽的Pluronic P123膠束制劑的研究
　　薄膜分散法制備物理包封多西他賽的Pluronic P123膠束(簡稱P123膠束);以單因素考察結(jié)果為基礎(chǔ),進行正交設(shè)計實驗,優(yōu)化了P123膠束的制備工藝和處方;為提高穩(wěn)定性,制備了P123膠束凍干制劑;研究了P123膠束的理化性質(zhì)包括外觀形態(tài)、粒徑、zeta電位、載藥量和包封率;透析法研究了P123膠束在磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4,0.5%吐溫80)中的體外釋藥行為;四

6、唑藍比色法(MTT法)研究了P123膠束對人肝癌細胞系HepG2、人肺癌細胞系A(chǔ)549和小鼠黑色素癌細胞系B16的體外抗腫瘤活性;采用接種鼠源B16黑色素瘤的昆明小鼠,考察了P123膠束的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　高效液相色譜法測定多西他賽的含量,冷凍干燥前,P123膠束的包封率和載藥量分別是(92.07±1.77)%和(2.35±0.08)%,凍干后,包封率和載藥量均有所降低,分別是(86.34±3.32)%和(2.12±0.09)

7、%。冷凍干燥前后,透射電子顯微鏡(TEM)觀察P123膠束均呈球形或類球形;動態(tài)光散射法(DLS)測定P123膠束的粒徑,凍干前P123的平均粒徑為38.9 nm,粒度跨度為9～55 nnl,凍干后其粒徑稍有增大,平均粒徑為50.7 nnl,粒度跨度為22-84 nm;凍干前后其zeta電位分別是(-10.56±2.34)mV和(-12.45±3.24)mV;P123膠束的體外釋藥行為符合Weibull方程模型:Inln(1/(1-y/

8、100))=0.738Int-1.796(r=0.9935),而多帕菲(R)符合一級動力學(xué)模型:1n(100-y)=-0.198t+4.462(r=0.9990);體外細胞毒性結(jié)果顯示,P123膠束對HepG2、A549和Bl6細胞的IC50值分別是(0.34±0.02)μM、(0.44±0.05)μM和(0.49±0.08)μM,均低于多帕菲(R)組相應(yīng)的IC50值(分別是(0.96±0.05)μM、(0.74±0.02)μM和(0.

9、72±0.10)μM),且均具有顯著性差異;體內(nèi)抗腫瘤活性結(jié)果顯示,P123膠束的抑瘤率為91.6%,優(yōu)于多帕菲(R)的76.3%(P＜0.01),并降低了藥物的毒性。
　　2.Pluronie P123-多西他賽結(jié)合物膠束制劑的研究
　　在多西他賽的2'位羥基用丁二酸酐活化成羧基后,多西他賽通過酯鍵連接到Pluronie P123上得到P123-DTX結(jié)合物。P123-DTX結(jié)合物的結(jié)構(gòu)用質(zhì)子核磁共振光譜(1H-NMR)表

10、征。由于其兩親性,P123-DTX結(jié)合物能夠自組裝形成膠束。P123-DTX結(jié)合物膠束通過透析法制備而成;研究了P123-DTX結(jié)合物膠束的臨界膠束濃度、載藥量、外觀形態(tài)、粒徑和zeta電位等理化性質(zhì);分別在pH值為1.2、5.0、6.8、7.4的PBS和小鼠血漿中研究了P123-DTX結(jié)合物膠束的體外釋藥行為;采用MTT法研究了P123-DTX結(jié)合物膠束對人肝癌細胞系HepG2、人乳腺癌細胞系MCF-7和小鼠黑色素癌細胞系B16的體外

11、抗腫瘤活性;采用接種鼠源B16黑色素瘤的昆明小鼠,考察了P123-DTX結(jié)合物膠束的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　與多西他賽原料比較,羧基化多西他賽的1H-NMR譜中清楚地觀察到額外出現(xiàn)δ2.5-2.7處的多重峰,其代表丁二酸酐OCOCH2CH2COOH上質(zhì)子的化學(xué)位移峰,證明羧基化多西他賽的成功合成。與Pluronic P123原料比較,P123-DTX結(jié)合物1H-NMR譜中出現(xiàn)一系列新的吸收峰,正好與多西他賽的1H-NMR譜相對應(yīng),可

12、知多西他賽成功連接到Pluronie P123上;芘探針熒光光譜法測得P123-DTX結(jié)合物膠束的臨界膠束濃度為(1.34±0.07)×10-5 mol/L;紫外可見分光光度法測得P123-DTX結(jié)合物膠束的載藥量為(13.69±0.52)%;TEM觀察P123-DTX結(jié)合物膠束呈現(xiàn)球形或類球形,大小均勻,分散良好,DLS測得其平均粒徑為(85.3±1.59)nm,多分散系數(shù)為0.267:P123-DTX結(jié)合物膠束的體外釋藥行為是pH敏

13、感的,pH7.4和pH6.8條件下釋放很慢,僅3.5和3.7%DTX釋放。而隨著pH值的降低,藥物釋放加速,可能由于酯鍵的pH敏感性。血漿中釋藥速度更快,這可能由于化學(xué)水解和酶解酯鍵的雙重機制:體外細胞毒性結(jié)果顯示,P123-DTX結(jié)合物膠束對HepG2、MCF-7和B16細胞的IC50值分別是(1.14±0.13)μM、(1.44±0.15)μM和(1.68±0.22)μM,均高于多帕菲(R)組相應(yīng)的IC50值(分別是(0.66±0.