重組融合蛋白rMBP-NAP制備工藝研究.pdf

1、本課題組的前期構(gòu)建并篩選到融合表達(dá)MBP和NAP的基因工程菌E.coliTB1(pMAL-c2x-napA)，藥效學(xué)研究結(jié)果表明，重組融合蛋白rMBP-NAP在小鼠模型中能夠通過(guò)增強(qiáng)Th1型細(xì)胞因子的分泌起到抗腫瘤的效果。本實(shí)驗(yàn)為了優(yōu)化基因工程菌E.coliTB1(pMAL-c2x-napA)實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)體系，降低發(fā)酵成本建立發(fā)酵罐小試生產(chǎn)工藝，為中試生產(chǎn)提供參數(shù)，從發(fā)酵培養(yǎng)基選擇、搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化、10L發(fā)酵罐小試生產(chǎn)三方面對(duì)重組融

2、合蛋白rMBP-NAP的制備工藝進(jìn)行研究。
　　研究方法
　　(1)發(fā)酵培養(yǎng)基及250mL搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化
　　采用控制單一變量的方法對(duì)每個(gè)參數(shù)進(jìn)行逐一優(yōu)化，首先對(duì)培養(yǎng)基種類(lèi)和成分進(jìn)行篩選，在此基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵條件包括種子菌齡、接種量、裝液量、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度的選擇、pH值、溫度等逐一進(jìn)行優(yōu)化。
　　(2)250mL搖瓶?jī)?yōu)化前后結(jié)果比較
　　分別利用優(yōu)化前后的條件進(jìn)行大腸桿菌E.coliTB1搖瓶發(fā)酵生

3、產(chǎn)rMBP-NAP，比較發(fā)酵終止后的菌體OD600、rMBP-NAP的表達(dá)量。
　　(3)10L發(fā)酵罐小試生產(chǎn)
　　以搖瓶?jī)?yōu)化獲得的最適發(fā)酵條件，進(jìn)行10L發(fā)酵罐小試生產(chǎn)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵終止的菌體OD600和rMBP-NAP的表達(dá)量進(jìn)行比較，獲得菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線和rMBP-NAP的表達(dá)量變化曲線。
　　結(jié)果
　　(1)發(fā)酵培養(yǎng)基及250mL搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果
　　培養(yǎng)基篩選結(jié)果顯示M9(以3％的比例加入酵母

4、浸粉)培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。最優(yōu)發(fā)酵條件如下:取活化19h后的E.coliTB1作為一級(jí)種子液(LB培養(yǎng)基，含1/1000Amp)，以6％(種子液體積/培養(yǎng)液體積)的接種量將一級(jí)種子接種到裝有50mLpH為6.6的二級(jí)發(fā)酵液M9(以3％的比例加入酵母浸粉，含1/1000Amp)的250mL搖瓶中，37℃下擴(kuò)大培養(yǎng)3h后，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.7mmol/L繼續(xù)37℃誘導(dǎo)表達(dá)21h。通過(guò)優(yōu)化前和優(yōu)化后的發(fā)

5、酵條件比較發(fā)現(xiàn)，利用優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，rMBP-NAP的產(chǎn)率顯著提高，rMBP-NAP的產(chǎn)率由59mg/L提高到592mg/L，提高了將近10倍。
　　(2)10L發(fā)酵罐小試生產(chǎn)
　　以搖瓶?jī)?yōu)化獲得的最適發(fā)酵條件進(jìn)行10L發(fā)酵罐的小試生產(chǎn)，結(jié)果表明發(fā)酵結(jié)束后濕菌體量為30g/L，可溶性總蛋白的濃度為1738mg/L，目的蛋白占總蛋白的比例為10.4％。
　　結(jié)論
　　(1)通過(guò)在250mL搖瓶中對(duì)E.