重組人骨形成蛋白-7活性二聚體制備工藝優(yōu)化.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bonemorphogeneticprotein-7，BMP-7)是一種有較強活性的生物因子，具有強大的誘導(dǎo)骨組織形成和抗腎纖維化作用，臨床上已將rhBMP-7用于骨缺損的修復(fù)。 目前獲取rhBMP-7的主要途徑是利用原核表達系統(tǒng)，但它有些不利方面，如菌種易于產(chǎn)生退化、產(chǎn)生無活性的包涵體。對于退化菌種，需要對其復(fù)壯；包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性也是基因工程制藥的關(guān)鍵步驟，獲得高復(fù)性率工藝一直是各個實驗室追求的目標(biāo)。對r

2、hBMP-7的腎臟治療作用，必須以可溶性注射制劑的形式給藥，其內(nèi)毒素含量需控制在藥典規(guī)定的注射制劑限值以下。去除內(nèi)毒素的方法很多，其中廉價、方便、蛋白損失較少的方法是離子交換色譜法。本實驗采用陰離子色譜法去除rhBMP-7蛋白溶液中的內(nèi)毒素，采用可信度高的的凝膠法測定內(nèi)毒素含量。尋求實驗周期短、結(jié)果穩(wěn)定的體外活性測定方法，是制備可溶性rhBMP-7制劑的重要實驗部分。Balb/c3T3細胞作為rhBMP-7的效應(yīng)細胞，具有對rhBMP-

3、7靈敏度高、實驗結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點，為rhBMP-7制劑的制備提供了實驗依據(jù)。 研究目的： 表達rhBMP-7的工程菌存在表達不穩(wěn)定問題，嚴(yán)重影響后續(xù)工作，本論文試圖通過對退化菌種的復(fù)壯，以獲得表達量高、穩(wěn)定性好的工程菌。包涵體復(fù)性工藝優(yōu)化方面，存在復(fù)性率低的問題，本實驗在實驗室老師所用復(fù)性方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化加入添加劑的透析復(fù)性工藝，以期得到更多的rhBMP-7活性二聚體。探索疏水色譜法對rhBMP-7純化并同時復(fù)性。嘗試制

4、作可溶性rhBMP-7蛋白溶液，并探索應(yīng)用陰離子交換色譜法去除內(nèi)毒素，以得到rhBMP-7注射制劑，發(fā)揮其對腎臟疾病的治療作用。NIH3T3細胞作為rhBMP-7體外活性測定細胞，具有實驗結(jié)果穩(wěn)定性差的缺點，影響可溶性rhBMF-7注射制劑制備的后續(xù)工作。本實驗選擇Bal/c3T3細胞作為rhBMP-7體外測活的效應(yīng)細胞，旨在建立實驗周期短、結(jié)果穩(wěn)定的體外測活方法。 研究方法： 1.對表達rhBMP-7的退化菌種復(fù)壯：①

5、檢測退化菌種的質(zhì)粒丟失情況；②檢測質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)是否正確；③根據(jù)檢測結(jié)果，更換載體pBV221，重新構(gòu)建表達rhBMP-7的工程菌；④對重新構(gòu)建的菌種進行質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測。 2.采用梯度透析法對rhBMP-7復(fù)性，并嘗試用疏水色譜法對包涵體蛋白純化并復(fù)性。 3.復(fù)性所得蛋白溶液經(jīng)陰離子色譜柱去除內(nèi)毒素，凝膠法檢測內(nèi)毒素去除效果。 4.選擇Balb/c3T3細胞作為rhBMP-7體外測活的效應(yīng)細胞，rhBMP-7對細胞作

6、用時采用含0.4％血清的培養(yǎng)基維持細胞存活，rhBMP-7作用濃度在1ng/ml～60μg/ml范圍內(nèi)。 研究結(jié)果： 1.經(jīng)檢測，質(zhì)粒存在于退化菌種。經(jīng)測定目的基因序列正確，更換載體，重新構(gòu)建菌種，得到的工程菌目的蛋白表達量達到退化前并且遺傳穩(wěn)定性良好。 2.確定了rhBMP-7透析復(fù)性的條件，在4℃、pH8.0條件下，并添加0.4mol/LL-精氨酸的復(fù)性液中對rhBMP-7復(fù)性效果較好。 3.陰離子色

7、譜柱去除rhBMP-7蛋白溶液中的內(nèi)毒素，凝膠法測得洗脫液中內(nèi)毒素含量在注射制劑限值以下。 4.Balb/c3T3細胞作為rhBMP-7體外活性測定的效應(yīng)細胞，較NIH3T3細胞重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定。 結(jié)論： 本實驗室構(gòu)建的hBMP-7/pBV221/E.coliBL21工程菌發(fā)生退化，BMP-7表達量降低，通過對工程菌復(fù)壯，得到的工程菌目的蛋白表達量高、遺傳穩(wěn)定性好。在rhBMP-7透析復(fù)性液中加入助溶劑L-精氨