重組人骨形成蛋白2和重組人神經(jīng)生長因子β在三度根分叉缺損修復(fù)過程的作用研究.pdf

1、背景和目的：
　　通過炎癥，創(chuàng)傷或腫瘤造成的牙周支持組織的水平缺損的重建在臨床上依然是一個難題。用組織工程學(xué)方法促進(jìn)牙槽骨再生修復(fù)牙周疾病引起的牙周組織缺損是近年來的研究熱點(diǎn)。骨組織工程主要的瓶頸是形成的組織工程骨與天然的生理骨仍有很大差距?？赡艿闹饕蚴菦]有實(shí)現(xiàn)組織工程骨的神經(jīng)化。
　　生長因子在骨形成過程起很重要的作用，這主要是通過刺激間充質(zhì)干細(xì)胞向硬組織方向的分化。在過去的幾年里，多種生長因子具有骨再生潛力，包括成纖

2、維細(xì)胞生長因子，血小板衍生因子，胰島素樣生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，和骨形成蛋白(BMP)。在這些因子中，重組人骨形成蛋白2(rhBMP2)是促進(jìn)牙周組織再生的最具潛力的因子。除了它可以促進(jìn)再生骨的量之外，它還可以安全的應(yīng)用到病人身上，在rhBMP2處理的區(qū)域可以形成正常的骨。但是rhBMP2形成的骨的質(zhì)量并不那么完美。最主要的缺陷是rhBMP2刺激再生的骨具有比較低的臨床愈合能力，機(jī)械性能比較差，還有異位成骨。這些異

3、常阻礙了它對大的骨缺損的臨床應(yīng)用。因此找到新的方法來改善再生骨的質(zhì)及量非常必要。
　　越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)系統(tǒng)和骨的形成，修復(fù)和改建密切相關(guān)。正常骨組織中有廣泛的肽能神經(jīng)分布，尤其在成骨活動活躍區(qū)域，新生骨組織中神經(jīng)支配的現(xiàn)象更為顯著。在人長骨不連患者中，發(fā)現(xiàn)在局部組織中存在神經(jīng)纖維缺失的現(xiàn)象，并認(rèn)為失神經(jīng)支配可能是影響骨折正常愈合的原因之一。在截癱和顱腦外傷伴有四肢骨折的患者中，往往發(fā)現(xiàn)骨折骨痂異常增大，甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)周圍異位骨

4、化現(xiàn)象，然而在動物失神經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究中，雖然證實(shí)骨痂形成加快且明顯增大，但骨痂密度不規(guī)則，骨痂力學(xué)強(qiáng)度明顯減弱。在下牙槽神經(jīng)切斷的大鼠中，牙槽骨的改建活動被抑制。而rhBMP2再生的骨和這些具有神經(jīng)損傷的病人或?qū)嶒?yàn)動物具有相似的表現(xiàn)。我們的假說是能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)來源的生長因子可能也會影響骨的改建。
　　神經(jīng)生長因子(NGF)是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，可以促進(jìn)神經(jīng)的生長分化，最近也被報道它可以促進(jìn)骨的改建活動，并且在骨折愈合過程起

5、重要作用。另外，它還可以促進(jìn)人牙周韌帶細(xì)胞骨及牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白，骨橋蛋白和堿性磷酸酶的表達(dá)，并且它還調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞和牙周韌帶細(xì)胞的增殖和分化，這表明它在體內(nèi)促進(jìn)牙周組織再生的潛力。綜上所述，這些之前的研究表明NGF在促進(jìn)新骨生成及改建方面可能有效。
　　因此，本研究將rhBMP2和NGF局部聯(lián)合應(yīng)用到比格犬三度根分叉缺損處，觀察再生骨的質(zhì)與量，并觀察再生牙周組織中神經(jīng)纖維的形態(tài)和分布。
　　方法
　　第一部分:本實(shí)驗(yàn)在

6、六條比格犬的下頜2，3，4前磨牙建立了36個炎性三度根分叉缺損模型。rhBMP2和rhβ-NGF通過可吸收的凝膠局部應(yīng)用到牙周缺損處。按拉丁方設(shè)計(jì)將36顆實(shí)驗(yàn)牙分為6組，分別為:A空白對照組作為對照組A，B空白凝膠組作為對照組B，C凝膠+0.4％(4μg/ml) rhBMP-2，D凝膠+2％(20μg/ml) rhNGF，E凝膠+0.4％(4μg/ml)BMP-2+2％(20μg/ml) rhNGF,F凝膠+0.2％(2μg/ml) r

7、hBMP-2+1％(10μg/ml) rhNGF。八周后處死動物，再生牙周組織的質(zhì)和量通過掃描電鏡，鈣磷比例及組織學(xué)測量進(jìn)行觀測。
　　第二部分:本實(shí)驗(yàn)動物手術(shù)部分同第一部分。標(biāo)本處理采用冰凍切片，通過PGP-9.5免疫組織化學(xué)染色方法觀察比格犬下頜前磨牙三度根分叉缺損再生牙周膜中神經(jīng)的量，形態(tài)及分布情況。
　　結(jié)果
　　第一部分:實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明骨形成蛋白2單獨(dú)應(yīng)用就可以促進(jìn)再生骨的量。NGF單獨(dú)應(yīng)用組可以觀察到更多的新

8、骨生成伴隨更高的鈣磷比值。另外，掃描電鏡觀察顯示在這一組中新生的組織中膠原束的直徑比對照組中的高。骨形成蛋白2和神經(jīng)生長因子聯(lián)合應(yīng)用的兩組比兩個對照組可以觀察到更高的鈣磷比值，并且伴有膠原纖維表明的更多的鈣化物。另外，兩種生長因子的聯(lián)合應(yīng)用比任何一種因子的單獨(dú)應(yīng)用促進(jìn)更多面積的骨生成和更多的牙骨質(zhì)，兩種生長因子對牙周組織再生存在協(xié)同作用。
　　第二部分: PGP9.5免疫組織化學(xué)染色陽性的纖維可以在所有再生牙周膜中觀察到。但是它們

9、的數(shù)目比較少而且大部分分布比較分散。再生牙周膜中切跡區(qū)域PGP9.5陽性區(qū)域?qū)Υ藚^(qū)域的牙周膜面積（除去牙齒，牙槽骨和血管）的百分比(POP)為1.93±0.92％，明顯低于正常對照(3.09±1.12％)。再生的魯菲尼小體僅僅在17個標(biāo)本中的3個觀測到。與正常牙周膜中的魯菲尼小體相比，再生牙周膜中的具有更少的分支。細(xì)的自由神經(jīng)末梢在再生牙周膜中占主導(dǎo)地位。它們大多數(shù)外形平滑，末端逐漸變細(xì)不形成任何末梢。另外，再生的牙周膜中牙周韌帶在牙槽