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文檔簡介
1、研究背景:
正常透明的角膜是由角膜上皮層,前彈力層,基質(zhì)層,后彈力層和內(nèi)皮層五部分組成,約占眼外層纖維膜的1/6,表面被淚膜覆蓋,無新生血管和淋巴管。其中角膜上皮層是由4-6層非角化的復(fù)層鱗狀上皮緊密排列而成。角膜上皮層厚度為0.05mm,占整個角膜厚度的5%,角膜緣上皮基底層含有角膜緣干細胞,可逐漸分化為瞬間擴充細胞及終末分化上皮細胞,是角膜上皮增殖和修復(fù)的來源,其生命周期大約7-14天。角膜上皮層可分為細胞層和基底膜,
2、細胞層包括基底細胞,翼狀細胞和表層細胞?;啄な怯苫咨掀ぜ毎掷m(xù)分泌,在其下形成由Ⅳ型膠原纖維,層粘連蛋白和其他蛋白組成的50nm厚的一層膜。淺表上皮細胞之間的緊密連接可阻止淚液中的水分進入基底層,角膜上皮大范圍缺損時可導(dǎo)致角膜水腫增厚,角膜透明性下降,嚴重影響視力。
完整的角膜上皮是眼球抵御病原微生物侵襲的第一道屏障,也是維持良好視覺的必需條件。角膜上皮像機體其他上皮組織一樣,容易不斷遭受外界的物理,化學(xué)和生物等有害因
3、子的侵襲,導(dǎo)致?lián)p傷和失去屏障功能。臨床上,外傷,感染和手術(shù)等常易導(dǎo)致角膜上皮損傷,從而導(dǎo)致角膜新生血管,角膜白斑及角膜潰瘍穿孔等嚴重并發(fā)癥,嚴重影響視力。角膜上皮損傷合理的修復(fù)對于維持角膜透明和清晰視覺具有至關(guān)重要作用。角膜上皮損傷修復(fù)涉及細胞增殖及分化,細胞遷徙,基質(zhì)結(jié)構(gòu)重建等一系列過程,而這些過程由不斷釋放的rhEGF,bFGF等相關(guān)生長因子進行網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。這些生長因子對于角膜上皮損傷修復(fù)具有重要作用。
臨床上,角膜上皮
4、損傷十分常見,常用的生長因子類藥物中有:重組人表皮生長因子(recombinanthumanepithelialgrowthfactor,rhEGF)和重組牛堿性成纖維細胞生長因子(recombinantbovinebasicfibroblastgrowthfactor,bFGF),均對角膜上皮損傷修復(fù)治療具有一定的效果。
目前研究發(fā)現(xiàn),rhEGF和bFGF均可促進創(chuàng)面修復(fù),但兩者的機制及側(cè)重點不同:EGF促修復(fù)的機制主要
5、是與鄰近創(chuàng)面基底細胞膜上的EGF受體結(jié)合,促進角膜緣基底膜細胞向表層移行,先形成單細胞層,然后經(jīng)有絲分裂形成復(fù)層上皮細胞而加速角膜創(chuàng)面的上皮化。bFGF主要是通過促分裂效應(yīng)和非促分裂的激素樣活性,特別是通過激活角膜基質(zhì)成纖維細胞分裂增殖活性,使膠原纖維分泌增加、毛細血管增多和管腔擴張,而發(fā)揮促修復(fù)作用。然而,bFGF可以促進血管內(nèi)皮細胞增殖分化,誘導(dǎo)毛細血管內(nèi)皮細胞侵入三維膠原基質(zhì)中,形成類似于毛細血管的管樣結(jié)構(gòu),促進角膜血管新生。
6、r> 因此,明確rhEGF與bFGF促進角膜上皮損傷修復(fù)效果,以及是否誘導(dǎo)角膜新生血管和角膜瘢痕,對于更合理、更安全地指導(dǎo)臨床用藥,確定其臨床應(yīng)用的最佳時機具有重要意義,本論文從體外細胞增殖及遷徙實驗著手,結(jié)合體內(nèi)角膜上皮損傷修復(fù)及血管新生動物實驗進行研究,為兩者效果及不良反應(yīng)的深入研究奠定基礎(chǔ)。
研究目的:
1.從體外實驗初步探討重組人表皮生長因子(RecombinantHumanEpithelial
7、GrowthFactor,rhEGF)和重組人堿性成纖維細胞生長因子(RecombinantHumanBasicFibroblastGrowthFactor,bFGF)對角膜上皮細胞,基質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞的增殖,遷徙作用影響。
2.從體內(nèi)實驗初步探討重組人表皮生長因子rhEGF與重組牛堿性成纖維細胞生長因子bFGF對角膜上皮損傷修復(fù)及血管新生的影響。
研究方法:
1.體外實驗:(1).首先應(yīng)用
8、MTT方法篩選rhEGF與bFGF促進角膜上皮細胞SD-HCEC1增殖的最佳濃度,即在96孔板中接種SD-HCEC1,每孔加角膜上皮細胞懸液200ul,1000個細胞/孔,每5個孔一組,培養(yǎng)24h后,分別更換下列培養(yǎng)液:含0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/mlrhEGF和含0ng/ml,2.5ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/mlbFGF的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,在5孔未加細
9、胞的空白孔中加200ul培養(yǎng)液作為空白對照。每天換液,5天后MTT檢測SD-HCEC1細胞增殖情況。
(2).然后分別觀察該最佳濃度下應(yīng)用MTT方法檢測角膜上皮細胞(SD-HCEC1)、角膜基質(zhì)細胞(RKCs)和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)的增殖情況。消化對數(shù)生長期細胞,離心、計數(shù)和重懸制備細胞懸液,接種到96孔板中,SD-HCEC1和RKCs每孔1000個細胞,P3代的HUVECs每孔5000個細胞。細胞培養(yǎng)箱中
10、靜置培養(yǎng)24h后,分別換成含10ng/mlrhEGF,bFGF和兩者都不含的角膜上皮,基質(zhì)和血管內(nèi)皮培養(yǎng)液,每隔24h,每代細胞隨機取5孔,加入5ug/mlMTT試劑20ul,培養(yǎng)箱中孵育4h后,輕輕吸出上清液,PBS輕輕洗滌一次,加入150ulDMSO,酶標儀檢測溶液的光密度值(OD值),SD-HCEC1和RKCs的檢測波長570nm,校正波長630nm,HUVECs的檢測波長為490nm。以培養(yǎng)時間為橫坐標,以O(shè)D值為縱坐標,繪制細
11、胞增殖曲線。
(3).rhEGF與bFGF作用于SD-HCEC1,RKCs,HUVECs后的平板克隆形成檢測。消化對數(shù)生長期細胞,離心、計數(shù)和重懸后,接種到六孔板中,每孔接種100個SD-HCECls細胞,RKCs細胞每孔200個細胞,HUVECs每孔1500個細胞。細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),隔日半量換液。培養(yǎng)一周后,吸出培養(yǎng)液,用PBS輕輕漂洗后,加入固定液(甲醇∶冰醋酸=3:1)固定20min。PBS沖洗,經(jīng)過Giemsa
12、染液(1:10稀釋)染色10min,自來水沖洗后,在光鏡下觀察細胞克隆形態(tài),計算克隆數(shù)(>8個細胞為一個克隆)和克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。
(4).rhEGF與bFGF作用于SD-HCEC1,RKCs,HUVECs的ki67流式檢測。將SD-HCEC1細胞懸液吹打均勻,計數(shù),平均接種到五個大皿中,24h后,其中四個皿分別換液為含10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF,20ng/mlbFGF和不含r
13、hEGF,bFGF的角膜上皮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,消化收集細胞,PBS洗1次后離心5min,固定液固定15min,PBS洗1次,破膜液15min,PBS洗1次,加入1:100一抗,37℃孵育30min,PBS洗1次,加入熒光二抗1:100,37℃孵育20min,PBS洗1次,每個大皿分裝成3個EP管,定容至100ul,上機檢測,重復(fù)三次實驗。RKCs,HUVECs則分別換液為10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和不含rhEG
14、F,bFGF的角膜基質(zhì)和血管內(nèi)皮培養(yǎng)液作用48h,余方法同上。
(5).10ng/mlrhEGF和bFGF作用于HUVECs后的遷移能力檢測。將原代培養(yǎng)的第4代HUVECs接種于六孔板中,每孔接種的密度為1×107個/ml,待細胞增長基本融合后,用20ul的無菌槍頭在每孔中間垂直劃一道直線,PBS沖洗后,分別加入含0,10ng/mlrhEGF和10ng/mlbFGF的M199血管內(nèi)皮培養(yǎng)液進行培養(yǎng),每組選四個固定觀察點,定
15、期拍照觀察,應(yīng)用ImageJ軟件處理分析結(jié)果,未愈合率=觀察時未愈合面積/0h未愈合面積×100%。
2.體內(nèi)實驗:構(gòu)建角膜中央上皮損傷及角膜新生血管新西蘭白兔動物模型,將新西蘭白兔隨機分為三組(每組五只眼):rhEGF組,bFGF組和生理鹽水組(NS)。從術(shù)后第1天開始分別滴用易貝滴眼液(重組人表皮生長因子,rhEGF)、貝復(fù)蘇滴眼液(堿性成纖維生長因子,bFGF)和生理鹽水(NS),1滴/次,4次/日,觀察角膜上皮損傷
16、修復(fù)及新生血管面積變化。
結(jié)果:
1.rhEGF與bFGF促進SDHCEC1最佳作用濃度均為10ng/ml(1.356±0.218,2.056±0.210)。
2.MTT細胞增殖實驗結(jié)果:(1).對于SD-HCEC1的增殖,10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和不含rhEGF與bFGF的NegativeControl三組間差異經(jīng)析因設(shè)計方差分析存在顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(F=51.800,
17、P=0.000)。10ng/mlbFGF(P=0.000)與10ng/mlrhEGF(P=0.048)促進SD-HCEC1s細胞增殖較NegativeControl強有統(tǒng)計學(xué)差異。(2).對于RKCs的增殖,10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和NegativeControl三組間差異經(jīng)析因設(shè)計方差分析存在顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.604,P=0.000)。第1至3天,10ng/mlbFGF促進RKCs增殖效果不明顯,從第4
18、天開始10ng/mlbFGF增殖效果開始增快,10ng/mlrhEGF促進RKCs增殖與NegativeControl比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.263),提示rhEGF7天內(nèi)無明顯促進RKCs增殖作用,bFGF晚期促進RKCs增殖效果較好。(3).對于HUVECs增殖,10ng/mlbFGF與10ng/mlrhEGF與NegativeControl三組間經(jīng)析因設(shè)計方差分析存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=958.247,P=0.000)。10ng/m
19、lbFGF與10ng/mlrhEGF促進HUVECs增殖較NegativeControl強有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000),第2天開始,10ng/mlbFGF促進HUVECs增殖效果持續(xù)較強,提示bFGF促進血管內(nèi)皮細胞增殖效果較強。
3.細胞克隆形成實驗結(jié)果:(1).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和NegativeControl四組間SD-HCEC1s細胞克隆數(shù)經(jīng)Kruskal-Walli
20、sTest有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(x2=8.538,v=3,P=0.036)。其中,四組的Meanrank分別為10.67,7.83,2.67,4.83,提示10ng/mlrhEGF促進角膜上皮細胞SD-HCEC1克隆形成效果最好,10ng/mlbFGF組效果次之,不過10ng/mlrhEGF組細胞克隆形態(tài)較其余三組小。(2).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和NegativeControl四組間RKCs細胞
21、克隆數(shù)經(jīng)Kruskal-WallisTest有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(x2=9.100,v=3,P=0.028)。其中四組的Meanrank分別為5.33,7.17,11.00,2.50。提示20ng/mlbFGF促進RKCs的克隆形成效果最好,10ng/mlbFGF效果次之,10ng/mlrhEGF效果較差,NegativeControl的細胞克隆形態(tài)最小。(3).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和Negat
22、iveControl四組間HUVECs的細胞克隆數(shù)經(jīng)Kruskal-WallisTest有統(tǒng)計學(xué)差異(x2=8.390,v=3,P=0.039)。其四組的Meanrank分別為5.00,9.17,9.50,2.33。提示10ng/ml和20ng/mlbFGF組HUVECs克隆形成效果最好,10ng/mlrhEGF組次之。
4.Ki67流式結(jié)果:(1).10ng/mlrhEGF,10ng/ml和20ng/mlbFGF和Neg
23、ativeControl四組間SDHCEC1的ki67表達經(jīng)Kruskal-WallisTest有統(tǒng)計學(xué)差異(x2=10.385,v=3,P=0.016),其四組的Meanrank分別為5.00,8.00,11.00,2.00。提示20ng/mlbFGF組與10ng/mlbFGF組促進SD-HCEC1的ki67表達效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。(2).10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和NegativeCon
24、trol三組間RKCs的ki67表達經(jīng)Kruskal-WallisTest有統(tǒng)計學(xué)差異(x2=7.200,v=2,P=0.027),其三組的Meanrank分別為5.00,8.00,2.00。提示10ng/mlbFGF促進RKCs的ki67表達效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。(3).10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和NegativeControl三組間血管內(nèi)皮細胞HUVECs的ki67表達經(jīng)Kruskal-W
25、allisTest具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=6.489,v=2,P=0.039)。其三組的Meanrank分別為5.33,7.67,2.00。提示10ng/mlbFGF促進HUVECs的ki67表達效果最好,10ng/mlrhEGF效果次之。
5.HUVECs細胞遷徙實驗結(jié)果:10ng/mlrhEGF,10ng/mlbFGF和NegativeControl三組間未愈合面積百分比經(jīng)重復(fù)測量方差分析存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=1138.7
26、52,P=0.000),不同時間點間(F=959.377,P=0.000)。第8hour和24hour,10ng/mlbFGF與10ng/mlrhEGF組未愈合面積百分比均小于NegativeControl具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000),而10ng/mlbFGF組未愈合面積百分比較10ng/mlrhEGF組小也有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000),這提示bFGF與rhEGF都能促進HUVECs的遷移,而bFGF較rhEGF促進HUVECs遷
27、移能力強。
6.角膜上皮損傷愈合結(jié)果:rhEGF,bFGF與NS三組間經(jīng)重復(fù)測量方差分析存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=5.022,P=0.026)。術(shù)后1,2天,rhEGF組角膜上皮愈合率高于NS組(P=0.015)和高于bFGF組(P=0.022)有統(tǒng)計學(xué)差異,bFGF組愈合率較NS高無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.839)。術(shù)后第3天,rhEGF組,bFGF組與NS組角膜上皮愈合率分別為100%±0%,100%±0%,99.50%±0.7
28、0%。
7.角膜血管新生實驗結(jié)果:術(shù)后第12,15,18,21day,rhEGF,bFGF與NS三組間角膜新生血管面積經(jīng)重復(fù)測量方差分析存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=4.173,P=0.042),rhEGF組高于NS組無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.666)。rhEGF組低于bFGF組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.044);bFGF組高于NS組有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.020)。結(jié)果表明bFGF較rhEGF更具有促進角膜血管新生的作用。
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