重組PTD-SARA融合蛋白生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、促進(jìn)腎臟纖維化的關(guān)鍵因素之一被公認(rèn)為是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）和它下游的smad2和smad3依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Smads蛋白是TGF-β1家族信號(hào)從受體到核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，TGF-β1同啟動(dòng)素受體樣激酶5（Activin receptor like kinase 5，ALK5）結(jié)合，激發(fā)smad2和smad3發(fā)生磷酸化，之后與smad4結(jié)合并轉(zhuǎn)位入核，促進(jìn)TGF

2、-β1反應(yīng)性基因轉(zhuǎn)錄而致腎臟纖維化。SARA起初是作為Smad2結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)的，它通過(guò)兩個(gè)FYVE鋅指作用域定位于早期內(nèi)漿膜，其可與I型TGF-β受體結(jié)合，募集Smad2或Smad3到I型TGF-β受體進(jìn)行磷酸化，Smad2和Smad3磷酸化后就被SARA釋放，同Smad4裝配形成了Smad2/Smad4復(fù)合物及Smad3/Smad4復(fù)合物，即腎臟纖維化的基礎(chǔ)。SARA包含一C-末端和一Smad結(jié)合域（稱(chēng)SARA肽適體），后者在體外能

3、與Smad2、Smad3結(jié)合，在受體活化后分離，Smad結(jié)合域中存在SmadMH2的疏水溝，其與3個(gè)結(jié)構(gòu)基序結(jié)合，可選擇性與單體Smad結(jié)合并在體外阻止Smad3/Smad4形成復(fù)合物，進(jìn)而阻止組織纖維化，故SARA肽適體預(yù)防和治療腎臟纖維化將會(huì)有廣闊的前景，但smad2/smad3和SARA間的作用發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，SARA肽適體只有高效地進(jìn)入細(xì)胞才可充分發(fā)揮其生物學(xué)活性，由于其分子量過(guò)大，無(wú)法用于生物體內(nèi)治療。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Prote

4、in transduction domain,PTD)是近年發(fā)現(xiàn)的有穿細(xì)胞膜功能的一段多肽，能引導(dǎo)多肽或蛋白質(zhì)快速有效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。所以我們利用PTD將與其共價(jià)結(jié)合的SARA肽適體通過(guò)非受體依賴(lài)、非轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴(lài)、非能量依賴(lài)方式運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)技術(shù)，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。重組PTD-SARA融合蛋白前期已由我科室成功合成并保存。本實(shí)驗(yàn)將利用基因工程技術(shù)制備SARA蛋白，作為研究重組PTD-SARA融合蛋白生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組；檢測(cè)重組PTD

5、-SARA融合蛋白的穿膜作用，并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過(guò)比較重組PTD-SARA融合蛋白和SARA蛋白抑制TGF-β1誘發(fā)的腎臟上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用，對(duì)重組PTD-SARA融合蛋白生物學(xué)功能進(jìn)行初步的探索性研究，為臨床防治腎臟纖維化提供新的依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一：SARA蛋白的克隆、表達(dá)、純化及鑒定
　　目的：構(gòu)建質(zhì)粒pQE-30-SARA，對(duì)其進(jìn)行表達(dá)、純化、復(fù)性和鑒定。方法：使用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子合成SARA全長(zhǎng)基因，并對(duì)該

6、基因序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。將其克隆入載體pQE-30，構(gòu)建質(zhì)粒pQE-30-SARA，并在大腸桿菌M15中誘導(dǎo)其表達(dá)，以Ni2+-NTA親和層析柱純化SARA蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及免疫印跡（Western blot）方法鑒定，4℃PBS溶液中進(jìn)行透析復(fù)性。結(jié)果：成功地構(gòu)建了PQE-30-SARA蛋白表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)、純化及復(fù)性。結(jié)論：成功表達(dá)了具有生物學(xué)活性的SARA蛋白。SARA蛋白作為重組PTD-SARA

7、融合蛋白生物學(xué)功能初步研究實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組，為該實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二：重組PTD-SARA融合蛋白生物學(xué)功能初步研究
　　目的：研究重組PTD-SARA融合蛋白抗纖維化的生物學(xué)功能。方法：免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)重組PTD-SARA融合蛋白的穿膜作用；通過(guò)人腎小管近端上皮細(xì)胞（HK2細(xì)胞）形態(tài)學(xué)變化，免疫印跡法（Western blot）測(cè)定上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth mus

8、cle actin,α-SMA）和磷酸化Smad3（PhosphoSmad3）蛋白水平以觀測(cè)重組PTD-SARA融合蛋白抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘發(fā)的腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用。結(jié)果：重組PTD-SARA融合蛋白可高效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞胞質(zhì)與胞核。實(shí)驗(yàn)組PTD-SARA融合蛋白與對(duì)照組SARA蛋白相比，PTD-SARA融合蛋白能更顯著上調(diào)E-cadherin蛋白，

9、下調(diào)α-SMA和磷酸化Smad3蛋白水平，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：重組PTD-SARA融合蛋白可以高效地進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)及胞核，與SARA蛋白相比，重組PTD-SARA融合蛋白能明顯地抑制TGF-β1誘發(fā)的腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用。本研究為進(jìn)一步研究重組PTD-SARA融合蛋白防治腎臟纖維化奠定了基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：
　　1.成功表達(dá)了具有生物學(xué)活性的SARA蛋白，作為研究重組PTD-S