人Doppel蛋白生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、本文研究了PrP樣蛋白Dp1神經(jīng)細(xì)胞毒性及PrP蛋白神經(jīng)保護(hù)活性的生物學(xué)特征，初步鑒定了兩者各自的生物活性表位，部分闡明了Dp1與PrP的拮抗關(guān)系，Dp1細(xì)胞毒機(jī)制和誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的機(jī)制，這些工作將為深入研究prp<'C>的確切功能提供線索。對(duì)Dp1蛋白與PrP相互作用的研究還為朊病毒病發(fā)病機(jī)制的研究提供參考。 根據(jù)GenBank公布的人PRND cDNA序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，用PCR方法從人外周血白細(xì)胞總DNA中

2、擴(kuò)增獲得531 bp的人．PRND完整基因序列，測(cè)序正確后克隆至表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組人Dpl(rhDpl)蛋白。目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的60％以上。表達(dá)產(chǎn)物用Ni<'2+>親和層析柱純化及羥胺化學(xué)裂解法去除標(biāo)簽蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)證實(shí)，純化的rhDpl蛋白相對(duì)分子量約為15 kD。TrypanBlue及MTT實(shí)驗(yàn)顯示，在50μg/mL及以上劑量時(shí)，rhDp1蛋白具有抑制人神經(jīng)

3、母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，在100μg/mL及以上劑量時(shí)，rhDp1具有殺傷HeLa細(xì)胞的活性，呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。這些結(jié)果提示Dp1蛋白具有體外細(xì)胞毒作用，并呈現(xiàn)明顯的組織類(lèi)型特異性。為了解Dp1蛋白細(xì)胞毒性決定簇，對(duì)Dp1基因進(jìn)行了分段原核表達(dá)，主要針對(duì)Dp1蛋白上的三個(gè)α螺旋及兩個(gè)β折疊對(duì)其進(jìn)行劃分。采用純化后的各種分段表達(dá)蛋白進(jìn)行體外細(xì)胞毒性分析表明，其細(xì)胞毒性決定簇位于蛋白C端氨基酸81-122位，且與N端

4、無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)。 為研究正常朊蛋白(PrP)對(duì)Dp1蛋白細(xì)胞毒活性的影響，通過(guò)PrP蛋白與Dpl蛋白共處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞后觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，并檢測(cè)了二價(jià)銅離子對(duì)兩者相互作用的影響，結(jié)果證明正常朊蛋白即全長(zhǎng)野生型重組人PrP蛋白可明顯拮抗Dp1蛋白引起的神經(jīng)細(xì)胞毒活性，呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性，有神經(jīng)保護(hù)活性。且二價(jià)銅離子增強(qiáng)了PrP的神經(jīng)保護(hù)作用。 為了解PrP蛋白上何種結(jié)構(gòu)域?qū)p1蛋白細(xì)胞毒活

5、性起了拮抗作用，構(gòu)建了多個(gè)截?cái)嗉鞍穗牟迦胪蛔凅w，包括N端小片段、N端大片段、C端片段，以及含有插入了4個(gè)額外及7個(gè)額外八肽重復(fù)序列全長(zhǎng)PrP蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)這些突變體蛋白。細(xì)胞毒活性分析后發(fā)現(xiàn)，野生型PrP對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，而PrP蛋白N端大片段氨基酸32-121位缺失，4個(gè)及7個(gè)八肽重復(fù)序列額外插入后具有神經(jīng)細(xì)胞毒活性。進(jìn)一步將各突變體蛋白與Dp1共處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞后觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)Pr

6、P蛋白上Dp1蛋白神經(jīng)細(xì)胞毒性的拮抗部位位于PrP蛋白N端氨基酸的第23-90位。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明PrP蛋白N端無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)具有神經(jīng)保護(hù)作用。 為了進(jìn)一步分析Dp1對(duì)人SH-SY5Y細(xì)胞的作用及機(jī)制，將重組人Dp1蛋白作用SH-SY5Y細(xì)胞，Hoechst33342染色可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)濃集，呈致密的強(qiáng)熒光，呈現(xiàn)出明顯劑量依賴(lài)關(guān)系。DNA末端原位標(biāo)記染色法(TUNEL)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)多量的陽(yáng)性著色細(xì)胞。AnnexinV/PI雙染實(shí)驗(yàn)均檢測(cè)顯

7、示凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加。這些結(jié)果提示Dp1蛋白對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用可能是通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制。進(jìn)一步觀測(cè)Dp1蛋白細(xì)胞毒作用過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化，將Cu/Zn超氧化物歧化酶和一氧化氮合成酶(NOS)抑制劑L-NAME分布同時(shí)與Dp1蛋白導(dǎo)入SH-SY5Y細(xì)胞，觀測(cè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-NAME可明顯抑制Dp1蛋白引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性，而加入Cu/Zn超氧化物歧化酶對(duì)Dp1蛋白誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用無(wú)明顯影響。同時(shí)

8、我們還通過(guò)Western bloting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Dp1蛋白刺激人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞過(guò)程中NOS及血紅素氧化酶1(HO-1)的表達(dá)水平升高。這提示Dp1蛋白引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性可能是通過(guò)NOS及HO-1途徑介導(dǎo)的。 隨后，構(gòu)建了人PRND基因及PRNP N端缺失(△32-121)突變基因真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞48 h后可檢測(cè)到Dp1及PrP△32-121的表達(dá)。通過(guò)MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力；采用丫啶橙/溴化乙

9、錠(AO/EB)染色及DNA Ladder分析神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡；羅丹明123和DCFA染色測(cè)定線粒體跨膜電位和活性氧水平變化；底物染色反應(yīng)檢測(cè)caspase-3活性；Western-blot分析線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力明顯下降；AO/EB染色可見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；與空質(zhì)粒對(duì)照相比，線粒體跨膜電位下降和活性氧水平升高；caspase-3活性增強(qiáng)；凋亡細(xì)胞：Bcl-2蛋白表