莫能菌素生物合成調(diào)控基因的敲除.pdf

1、莫能菌素是由肉桂地鏈霉菌產(chǎn)生的一種聚醚類(lèi)抗生素,具有離子載體的生物活性,主要用于家禽、家兔等的抗球蟲(chóng)藥物。莫能菌素的生物合成基因簇涉及20個(gè)基因,其中有3個(gè)編碼調(diào)控因子。monH屬于LAL家族正調(diào)控因子,monRI屬于正調(diào)控因子SARP類(lèi),monRII屬于TetR類(lèi)負(fù)調(diào)控因子。雖然已知這三個(gè)調(diào)控基因的功能,但在莫能菌素合成途徑中的調(diào)控機(jī)理仍然未知。通過(guò)對(duì)調(diào)控基因的敲除、回補(bǔ)等手段,來(lái)研究調(diào)控基因?qū)δ芫厣锖铣傻挠绊?從而對(duì)莫能菌素基

2、因改造和提高莫能菌素的發(fā)酵產(chǎn)量具有十分重要的意義。
　　本文采用了豆油、豬油、油酸甲酯作為莫能菌素生物合成過(guò)程中的碳源和消泡劑。通過(guò)對(duì)肉桂地鏈霉菌培養(yǎng)基成分的調(diào)整,同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到pH的變化對(duì)莫能菌素的合成至關(guān)重要,莫能菌素的生物合成要控制在一個(gè)恒定的偏酸性的環(huán)境中。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基中氮源和微量元素比例的調(diào)整來(lái)降低發(fā)酵液的pH,從而提高并穩(wěn)定了莫能菌素的效價(jià)。
　　本文通過(guò)構(gòu)建monH的敲除載體,并通過(guò)篩選得到了雙交換的monH

3、敲除菌株。構(gòu)建了monH的過(guò)表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)入到敲除菌株和原始菌株中獲得回補(bǔ)菌株和過(guò)表達(dá)菌株。通過(guò)發(fā)酵效價(jià)測(cè)定,結(jié)果顯示,monH的敲除幾乎喪失莫能菌素合成能力,monH回補(bǔ)可恢復(fù)70％的產(chǎn)量,而monH過(guò)表達(dá)使產(chǎn)量提高了29%,這也證明了monH是莫能菌素生物合成基因簇中的正調(diào)節(jié)基因,對(duì)莫能菌素的合成起著直接作用。
　　本文同時(shí)還構(gòu)建了莫能菌素全基因簇敲除菌株,通過(guò)利用肉桂地鏈霉菌高效表達(dá)莫能菌素提供的前體物質(zhì)來(lái)高效異源表達(dá)其他