殺粉蝶菌素A1生物合成后修飾基因的功能研究.pdf

1、殺粉蝶菌素A1（Piericidin A1）是可以由多種鏈霉菌產(chǎn)生的α-吡啶酮類天然產(chǎn)物。殺粉蝶菌素A1作為一種線粒體呼吸作用抑制劑，通過競爭性結(jié)合，抑制復(fù)合體I中Fe-S簇的氧化和泛醌的還原，從而阻斷生物體的呼吸作用?；谶@一原理，殺粉蝶菌素A1顯示出了良好的生物活性，主要表現(xiàn)在對致病真菌，蠶，菜青蟲等。來自票霉素鏈霉菌杭州灣變種（Streptomyces piomogeues var. Hangzhouwanensis）的殺粉蝶菌素

2、A1生物合成基因簇已經(jīng)被克隆。核心結(jié)構(gòu)α-吡啶酮的生物合成機(jī)制已經(jīng)得到初步解析，但后修飾基因pieB1、pieB2和pieE，以及調(diào)控基因pieR的功能仍然不清楚。
　　本研究在分析殺粉蝶菌素A1生物合成途徑基礎(chǔ)上，利用體內(nèi)基因置換、基因回補(bǔ)，以及體外生化實(shí)驗(yàn)對殺粉蝶菌素A1生物合成基因簇中的兩個(gè)后修飾基因pieB1和pieB2的功能進(jìn)行研究。為獲得活性更好、毒性更小的殺粉蝶菌素衍生物建立了基礎(chǔ)。
　　在獲得甲基轉(zhuǎn)移酶基因p

3、ieB2基因缺失突變株，初步確定其與殺粉蝶菌素A1生物合成相關(guān)基礎(chǔ)上，研究了殺粉蝶菌素A1產(chǎn)生菌中甲基轉(zhuǎn)移酶基因pieB2的功能。首先利用接合轉(zhuǎn)移的方法構(gòu)建pieB2回補(bǔ)菌株ZZY-1。發(fā)酵結(jié)果顯示，對應(yīng)pieB2基因缺失突變株LQ-9不再產(chǎn)生殺粉蝶菌素A1，而是積累了一種脫甲基產(chǎn)物，回補(bǔ)菌株ZZY-1恢復(fù)了殺粉蝶菌素A1的產(chǎn)生。通過HPLC和LC-MS，以及NMR分析確定了此產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。然后，通過高保真PCR克隆pieB2基因到表

4、達(dá)載體pET28a上，構(gòu)建質(zhì)粒pJTU5997，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/plysE中誘導(dǎo)表達(dá)。N-末端融合組氨酸標(biāo)簽的PieB2在大腸桿菌中獲得可溶性表達(dá)，利用高效液相色譜檢測了PieB2的體外酶活，通過體外催化實(shí)驗(yàn)證明了甲基轉(zhuǎn)移酶PieB2的功能。
　　隨后，對殺粉蝶菌素A1產(chǎn)生菌生物合成基因簇中另一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因pieB1的功能進(jìn)行了研究。發(fā)酵結(jié)果顯示，該突變株LQ-8不再產(chǎn)生殺粉蝶菌素A1，而是積累

5、了一種中間產(chǎn)物，通過HPLC和LC-MS分析，以及核磁共振NMR鑒定了此產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過高保真PCR克隆pieB1基因到表達(dá)載體pET28a上，構(gòu)建質(zhì)粒pJTU5995，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/plysE中誘導(dǎo)表達(dá)，但是沒有獲得可溶性表達(dá)蛋白，無法通過體外催化證明了PieB1甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。于是，對pieD基因缺失突變株LQ-5進(jìn)行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)從pieB1基因突變株發(fā)酵積累的產(chǎn)物，結(jié)果恢復(fù)了殺粉蝶菌素A1的產(chǎn)