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文檔簡介
1、武夷菌素(Wuyiencin)是由不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)產生的一種新型農用抗生素,對多種真菌性病害具有良好的防治效果。采用物理化學誘變的方法選育武夷菌素高產菌株雖然取得了一些進展,但仍不能滿足育種和生產上需要。因此,采用分子生物學方法提高武夷菌素效價具有非常重要的意義。本研究構建了武夷菌素產生菌基因組文庫,克隆武夷菌素生物合成基因簇并且分析了其功能。此外
2、利用誘變的方法篩選到了武夷菌素生物合成阻斷突變株。結果如下:
1.采用pCC1FOS為載體構建了不吸水鏈霉菌武夷變種基因組文庫,文庫滴度為8.8×105cfu/ml,文庫可覆蓋基因組4倍以上。根據同類型抗生素生物合成基因設計特異性引物,最終確定以大環(huán)內酯類聚酮合成酶基因設計的引物篩選基因組文庫。
2.采用PCR方法對基因組文庫進行篩選得到了三個陽性克隆,對陽性克隆酶切后測序最終得到了長度為32509 bp的片
3、段,G+C含量為71.4%,與鏈霉菌基因組高G+C含量的特征相符。生物信息學分析表明武夷菌素可能是PKSⅠ型抗生素(聚酮類化合物),以模塊形式合成。該序列包含5個完整的ORF(開放閱讀框),推測orf1編碼武夷菌素生物合成起始模塊的酮還原酶(KR)和?;d體蛋白(ACP);orf2編碼合成過程中某一模塊的酮合成酶(KS);orf3長度為27855 bp,為克隆到的最長序列,其編碼的蛋白質包含5個聚酮合酶(KS),5個?;D移酶(AT),
4、5個脫氫酶(DH),五個酮還原酶(KR),1個烯基還原酶(ER)和5個?;d體蛋白(ACP),構成了合成中的五個模塊;orf4編碼武夷菌素生物合成中的硫酯酶(TE),參與聚酮長鏈的環(huán)化和水解;orf5為一種轉錄調控因子,編碼的蛋白質屬于LuxR蛋白家族,在轉錄過程起正向調節(jié)作用。
3.以武夷菌素產生菌CK-15為出發(fā)菌株,通過誘變處理得到一株喪失抑菌活性且性狀穩(wěn)定的突變株N1。突變株孢子絲為長螺旋形,孢子呈橢圓形,與出發(fā)菌
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