殺念菌素生物合成中糖基轉移酶的研究.pdf

1、殺念菌素是由鏈霉菌FR-008(Streptomyces sp. FR-008)所產生的具有廣譜抗真菌活性的多烯類抗生素。該類化合物主要來自細菌的次級代謝產物,并且實驗證實這類化合物是通過與真菌細胞膜內的甾醇分子相互作用形成通透性孔道來發(fā)揮抗真菌活性的。由于多烯類抗生素的廣譜抗菌活性以及耐藥性產生幾率小使得它們在臨床上的應用已經超過半個世紀,成為治療許多危重深部真菌感染的重要藥物。多烯類抗生素結構中普遍存在一個特殊的氨基海藻糖,它不僅在

2、該類抗生素發(fā)揮抗真菌活性中起到了重要作用,同時也影響了該類化合物的水溶性等理化性質。鑒于氨基海藻糖的重要性,長期以來科學家們對負責其加載的糖基轉移酶表現(xiàn)出了濃厚的研究興趣,但多烯類糖基轉移酶體外表達的困難使得對它的底物特異性以及影響酶催化活性的重要氨基酸殘基等方面的研究難以順利展開。本研究利用鏈霉菌FR-008生長周期短,遺傳操作簡單,產素水平高等優(yōu)點,建立了一個體內研究多烯類糖基轉移酶的生物化學檢測方法,并利用該方法揭示了多烯類糖基轉

3、移酶的底物特異性以及影響其催化活性的重要氨基酸殘基,為利用組合生物合成手段產生具有更高藥理活性的多烯類衍生物提供了理論依據。本研究主要內容包括：
　?、徘贸龤⒛罹厣锖铣苫虼刂锌赡茇撠熅幋a糖基轉移酶的基因fscMI獲得了不再攜帶糖基的殺念菌素糖苷配基,并且在用紅霉素啟動子控制下的fscMI基因進行回補實驗之后恢復了產生殺念菌素的能力,證明FscMI參與催化了氨基海藻糖的加載,是一個多烯類糖基轉移酶。同時,多烯類抗生素制霉菌素、

4、兩性霉素以及匹馬霉素生物合成基因簇中的同源蛋白(NysDI、AmphDI、PimK)也都能夠識別殺念菌素糖苷配基,并且在不同程度上恢復fscMI缺失突變株LX1中殺念菌素的產量,證明多烯類糖基轉移酶對糖苷配基的底物特異性并不是非常嚴格。
　?、茷榱私沂咎腔D移酶在糖苷配基也即聚酮骨架上的識別基團,本研究構建了DH11的點突變菌株LX8。DH11位于殺念菌素生物合成基因簇的聚酮合酶FscD上,負責殺念菌素結構中C22-C23位上雙鍵

5、的形成,該鍵處于多烯類抗生素的結構保守區(qū)并且是距離氨基海藻糖最近的一個雙鍵。突變株LX8不再產生殺念菌素,經LC-MS、Q-TOF以及特征紫外吸收峰的檢測確定該突變株產生了兩個具有相同分子量([M+H]+=1,127.3)以及預測結構式的殺念菌素六烯衍生物,[M+H]+1,127.3證明C23位已經被羥基取代,并且氨基海藻糖仍然能夠加載,推測這兩個新的化合物是由糖基加載在原始的C21位或新形成的C23位羥基上所引起的。該結果也進一步說明

6、多烯類糖基轉移酶對糖苷配基底物具有一定的選擇寬泛性。
　　⑶通過對糖基轉移酶FscMI的同源建模找到可能在糖基化過程中發(fā)揮重要作用的氨基酸殘基,并用定點突變的方法分別將這些氨基端殘基進行了突變,得到一系列糖基轉移酶FscMI的突變體。體內對這些 FscMI突變體識別天然底物的能力進行了定量檢測,發(fā)現(xiàn)Ser346、Ser361、His362和Cys387顯著影響FscMI催化能力。這是首例對多烯類糖基轉移酶中重要氨基酸殘基的研究,為

7、今后通過定向突變的方式改變多烯類糖基轉移酶的底物特異性,擴大其糖苷配基和糖基的識別范圍從而得到具有更高藥用價值的多烯類抗生素衍生物提供了理論依據。
　?、葘⒛罹厣锖铣苫虼刂写嬖诘腁BC轉運蛋白編碼基因fscTI和fscTII的生物學功能進行了研究。通過遺傳操作手段,構建了一個用于敲除轉運基因fscTI和fscTII的同源重組雙交換質粒,并通過接合轉移獲得了轉運蛋白缺失突變株LX10,對該突變株的發(fā)酵檢測顯示它不再產生多烯類