遲緩愛德華氏菌糖基轉(zhuǎn)移酶MltA的功能研究.pdf

1、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有極大危害的革蘭氏陰性病原菌。其宿主范圍廣，從魚類、兩棲類、爬行類直到哺乳類都有該菌感染的病例報道；更為重要的是，Edw.tarda除了給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大損失外，還是一種重要的人畜共患病病原菌，也是愛德華氏菌屬中唯一感染人類的成員，對人類的健康造成了威脅。Edw.tarda的致病性受到多因素的調(diào)控，其中一些毒力相關(guān)因子已經(jīng)被證實，包括攝鐵系統(tǒng)、溶血素、吞噬細(xì)胞毒殺

2、作用、Ⅲ型和Ⅵ型分泌系統(tǒng)、生物膜的形成、上皮細(xì)胞的侵染。然而，關(guān)鍵性毒力因子尚不明確。為了預(yù)防和治療遲緩愛德華氏菌病，深入地研究Edw.tarda的致病機(jī)理是十分有必要的。
　　 糖基轉(zhuǎn)移酶是一類自溶素，能夠切割肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，形成1，6-二酸酐胞壁酸殘基。根據(jù)氨基酸序列相似性和一致性基序，已知和假定的糖基轉(zhuǎn)移酶被劃分為四類。迄今為止，糖基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)被證實參與許多細(xì)胞過程，包括細(xì)胞生長

3、和分裂、細(xì)胞壁再生、運動性、藥物抗性、蛋白分泌、分化和致病性。
　　 Edw.tarda EIB202基因組注釋顯示存在一個假定的膜綁定的糖基轉(zhuǎn)移酶基因ETAT＿0715。該基因被預(yù)測編碼含有383個氨基酸的蛋白，該蛋白的C末端有一個3D結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與大腸桿菌糖基轉(zhuǎn)移酶A中的C末端結(jié)構(gòu)域有75％的一致性。因此，該基因被命名為mltA，假定蛋白被預(yù)測具有糖基轉(zhuǎn)移酶的功能。為了闡釋Edw.tarda中MltA的功能，本研究首先構(gòu)

4、建了框內(nèi)mltA缺失突變株△mltA和mltA過量表達(dá)菌株mltA+；然后分別比較缺失突變株、過量表達(dá)菌株和野生株在生物表型、抗生素敏感性和致病性等方面發(fā)生的變化。
　　 本研究利用重疊PCR和由自殺質(zhì)粒pRE118介導(dǎo)的二次同源重組成功構(gòu)建了缺失突變株△mltA。首先利用PCR擴(kuò)增得到mltA的上下游片段；然后利用重疊PCR將上下游片段連接起來，測序后克隆至線性pRE118質(zhì)粒；將得到的質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入大腸桿菌SY327、SY17

5、-1后與Edw.tarda野生株EIB202進(jìn)行接合；接合子中的重組質(zhì)粒與基因組發(fā)生二次同源重組后，用含有10％蔗糖的TSA平板篩選得到不含有自殺質(zhì)粒pRE118的mltA缺失突變株。通過將攜帶有卡那霉素抗性基因(Kanr)和完整mltA(包括啟動子區(qū)域)的片段的低拷貝質(zhì)粒pACYC184K電轉(zhuǎn)化入mltA缺失突變株后成功構(gòu)建了mltA過量表達(dá)Edw.tarda菌株。
　　 研究結(jié)果表明：在抗生素敏感性試驗中，一定濃度的氨芐青霉

6、素促進(jìn)野生株然而卻明顯抑制過量表達(dá)菌株中MltA的表達(dá)；與野生株相比，缺失突變株△mltA和過量表達(dá)菌株mltA+對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性顯著增強(qiáng)。在壓力存活實驗中，Edw.tarda中MltA的失活和過量表達(dá)均降低了該菌在寡營養(yǎng)和高滲透壓環(huán)境下的生存能力；在EDTA存在時，與野生株相比缺失突變株的自溶率下降，然而過量表達(dá)菌株的自溶率顯著提高。野生株和缺失突變株的生長速度并無明顯差異，然而過量表達(dá)菌株與前兩者相比生長速度略微降低。在

7、泳動性實驗中，與野生株相比，mltA+的運動能力顯著增強(qiáng)而△mltA的運動能力有所減弱。在生物膜實驗中，野生株、△mltA和mltA+在體外形成生物膜的能力雖存在顯著差異然而數(shù)值較小，并且三株菌均不能在垂死斑馬魚內(nèi)臟組織表面形成可觀察到的生物膜。脂多糖的SDS-PAGE電泳分析顯示，與野生株相比，AmltA在幾種低分子量LPS的合成上有所下降，而mltA的過量表達(dá)則導(dǎo)致另外兩種低分子量LPS的合成增加；LPS注射實驗表明，合成量增加的低