遲緩愛德華氏菌侵襲與粘附相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是一種革蘭氏陰性致病菌，具有廣泛的宿主范圍，包括魚類、兩棲類、爬行類及哺乳類，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且E. tarda是愛德華氏菌屬中唯一可以感染人的種類。目前為止，已經(jīng)報(bào)道粘附因子、對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力、鐵載體、溶血素、Ⅲ和Ⅵ型分泌系統(tǒng)都屬于E. tarda的致病因子，但是E. tarda的詳細(xì)致病機(jī)制還不明確。為預(yù)防和治療遲緩愛德華氏菌病，保障養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展

2、，迫切需要對(duì)E. tarda的致病機(jī)理深入研究。
　　在許多病原菌的致病過程中，病原菌可通過侵入宿主上皮細(xì)胞而引發(fā)系統(tǒng)性感染。病原菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和侵襲與多種毒力因子有關(guān)，包括侵襲素、粘附素、血凝素等。侵襲素主要由革蘭氏陰性致病菌產(chǎn)生，包括 N-端嵌在細(xì)菌外膜的β結(jié)構(gòu)域和 C-端位于胞外與宿主細(xì)胞結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，在細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用；粘附素與致病菌對(duì)宿主細(xì)胞的附著相關(guān)，一般包括菌毛粘附素和非菌毛粘附素；溫度敏感性血

3、凝素發(fā)現(xiàn)于禽病原性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC），也與細(xì)菌的致病性相關(guān)。
　　為了探索侵襲素、粘附素和溫度敏感性血凝素在E. tarda致病性中的作用，本研究利用overlap PCR和由自殺質(zhì)粒pRE112介導(dǎo)的二次同源重組成功構(gòu)建了上述基因的缺失突變株Δinv、Δadh及Δtsh。首先，擴(kuò)增inv、adh或tsh基因的上、下游片段，利用overlap PCR分別將其上下

4、游片段連接起來，克隆測(cè)序后與自殺質(zhì)粒pRE112連接，依次轉(zhuǎn)入大腸桿菌SY327和S17-1，并與E. tarda野生株H1進(jìn)行接合；接合子中的重組質(zhì)粒與基因組發(fā)生二次同源重組后，利用含10％蔗糖的TSA平板進(jìn)行篩選，得到不含自殺質(zhì)粒pRE112的inv、adh或tsh框內(nèi)缺失突變株。同時(shí)，將攜帶有inv基因全長片段及啟動(dòng)子區(qū)域的表達(dá)質(zhì)粒pACYC184電轉(zhuǎn)化進(jìn)入缺失突變株Δinv，構(gòu)建了inv過量表達(dá)菌株inv+。最后，分別對(duì)上述突變

5、株和過量表達(dá)株相對(duì)于野生株E. tarda H1在生長、生物被膜形成能力、溶血活性、對(duì)EPC細(xì)胞的侵染能力、致病性、LPS合成以及胞外蛋白分泌等方面的性狀改變進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：
　　(1)與野生株H1相比，Δinv與inv+生長速度基本沒有變化；Δinv對(duì)E. tarda生物被膜形成能力、溶血活性以及對(duì) EPC細(xì)胞內(nèi)化能力均明顯降低，而 inv+則明顯增強(qiáng)；Δinv對(duì)斑馬魚的致病性降低，而 inv+則回復(fù)到野生株的水平；Δ

6、inv與inv+對(duì)LPS的合成以及ECP的分泌沒有影響。
　　(2)粘附素缺失突變株Δadh生長速度沒有變化，但是對(duì)氨基糖苷類抗生素（卡那霉素、新霉素）和四環(huán)素類抗生素（四環(huán)素和強(qiáng)力霉素）的抗性相對(duì)于野生株H1明顯增強(qiáng)，可能與外膜蛋白和脂多糖結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)；同時(shí)Δadh在生物被膜形成能力、溶血活性、對(duì) EPC細(xì)胞的吸附能力以及對(duì)斑馬魚的致病性等方面均有明顯降低。
　　(3)相對(duì)于野生株H1，溫度敏感性血凝素缺失突變株Δtsh