遲鈍愛德華氏菌生物被膜狀態(tài)下耐藥相關(guān)基因與蛋白的研究.pdf

1、抗生素的發(fā)現(xiàn)使很多細(xì)菌感染性疾病得以控制，但是，隨著抗生素的廣泛使用，尤其是濫用和誤用，導(dǎo)致大量的耐藥菌株出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)了多重耐藥菌株和超級(jí)耐藥菌株。此外，無論是臨床上還是養(yǎng)殖業(yè)，很多細(xì)菌生物被膜的形成更是加劇了耐藥性的嚴(yán)重性。因此，闡明細(xì)菌生物被膜的耐藥機(jī)制對(duì)解決耐藥性具有重大意義。一直以來，遲鈍愛德華氏菌是魚類一種重要的致病菌，該菌生物被膜的形成造成魚類慢性感染并引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且抗生素的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致其非常嚴(yán)重的耐藥性，因此應(yīng)

2、對(duì)和解決遲鈍愛德華氏菌的耐藥性問題已刻不容緩。因此研究遲鈍愛德華氏菌生物被膜狀態(tài)下的耐藥機(jī)制具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
　　本論文利用蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)相關(guān)研究技術(shù)，分析遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda ATCC15947）生物被膜狀態(tài)下適應(yīng)性耐藥和獲得性耐藥過程中蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行，并且比較抗生素敏感株和土霉素傳代耐藥菌株的全基因組特征，探討遲鈍愛德華氏菌生物被膜下的耐藥相關(guān)蛋白與基因。
　　本研究

3、首先采用iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)生物被膜狀態(tài)下遲鈍愛德華氏菌土霉素耐藥菌株（獲得性耐藥）和抗生素敏感菌株（對(duì)照）在土霉素脅迫下（適應(yīng)性耐藥）蛋白質(zhì)組的變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在生物被膜狀態(tài)下，適應(yīng)性耐藥共有281個(gè)蛋白發(fā)生差異表達(dá)，其中有193個(gè)下調(diào)表達(dá)，88個(gè)上調(diào)表達(dá)；獲得性耐藥中，共有70個(gè)蛋白變化，包括20個(gè)下調(diào)表達(dá)和50個(gè)上調(diào)表達(dá)。隨后的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在適應(yīng)性耐藥中多個(gè)外膜蛋白（OppA、MalE、GlnH等

4、）的表達(dá)下調(diào)，核糖體相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，而與糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和TCA循環(huán)等產(chǎn)能代謝途徑相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)；在獲得性耐藥中，多個(gè)ATP依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NikA、OppA、MalE等）的表達(dá)發(fā)生下降，RNA聚合酶相關(guān)蛋白表達(dá)上升。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌趨化作用減弱，RNA聚合酶活性增加，進(jìn)而使翻譯途徑增強(qiáng)。
　　本研究中利用q-PCR和Western blotting技術(shù)對(duì)差異蛋白中的部分差異蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核糖

5、體、代謝途徑相關(guān)酶以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因相應(yīng)的mRNA水平上的變化基本與蛋白質(zhì)水平上一致；Western blotting分析表明PflB和PspB蛋白在生物被膜耐藥中確實(shí)發(fā)生了變化，可能是生物被膜耐藥相關(guān)蛋白。此外，由于在兩種耐藥行為中，細(xì)菌能量代謝途徑都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此對(duì)產(chǎn)能關(guān)鍵途徑TCA循環(huán)中的兩種重要酶進(jìn)行了活性測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示，生物被膜耐藥過程中琥珀酸脫氫酶（SDH）和?-酮戊二酸脫氫酶（?-KGDH）的活性的確都明顯下

6、降，提示細(xì)菌可能通過下調(diào)胞內(nèi)的能量代謝介導(dǎo)生物被膜耐藥。
　　此外，為了研究基因突變對(duì)細(xì)菌耐藥的影響，本論文利用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)土霉素耐藥菌株和敏感菌株的基因組進(jìn)行了重測(cè)序。分析比較結(jié)果表明，38個(gè)已知的基因，如pgm、ppsA、gplK、tolC等發(fā)生了突變，這些基因的位點(diǎn)突變可能參與了細(xì)菌耐藥的過程。此外，還有8個(gè)蛋白在獲得性耐藥中表達(dá)水平發(fā)生變化，同時(shí)基因上也發(fā)生了突變（fliC, parB, accA等），提示這些基因的